人乳头瘤病毒衣壳蛋白结构生物学研究进展

范飞，柳欣林，李智海，王大宁，夏宁邵,，李少伟,Δ

(1.厦门大学 生命科学学院/国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102；2. 厦门大学 公共卫生学院/分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102)

人乳头瘤病毒衣壳蛋白结构生物学研究进展

范飞1，柳欣林1，李智海1，王大宁2，夏宁邵1,2，李少伟1,2Δ

(1.厦门大学 生命科学学院/国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102；2. 厦门大学 公共卫生学院/分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102)

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染会导致人类多种疾病，尤其是女性宫颈癌。HPV衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2形成的T=7的正二十面体结构，L1蛋白具有较强的免疫原性且能在体外自组装形成与天然病毒结构相似的类病毒颗粒(virus like particle，VLP)，是目前HPV疫苗的理想形式。此外，L1、L2蛋白在病毒的感染中发挥着重要作用。对HPV衣壳蛋白结构和功能的研究，有助于进一步阐明HPV的颗粒组装机制、致病机理及感染机制，为今后开展HPV相关疾病的研究提供指导方向。本文就HPV衣壳蛋白的结构、病毒颗粒组装及衣壳蛋白间相互作用研究进展进行综述。

人乳头瘤病毒；衣壳蛋白；结构生物学

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类双链DNA病毒，能感染人的表皮及黏膜上皮，诱导上皮组织的疣状增生乃至良恶性肿瘤。目前已分离鉴定出170多种不同的HPV型别[1]，根据HPV的致病力或致癌危险性的大小，将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV的感染会引起宫颈、阴道、阴茎、肛门和口咽的上皮内瘤变或癌变[2]。根据2012年WHO统计数据显示，全球由HPV感染导致的癌症病例达到527,624例，病死率为50.3%[3]；据统计约86%的病例发生在发展中国家，我国每年宫颈癌新发病例约6万人，死亡约2万人[4]。

天然的HPV呈现T=7的正二十面体对称结构，其结构简单，衣壳蛋白由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成，L1蛋白占病毒衣壳蛋白总量的80%～90%。L1蛋白可在体外多种表达系统中表达[5]，并能自组装成与天然HPV病毒高度相似的类病毒颗粒(virus like particle，VLP)，动物实验表明其具有较高的免疫原性，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体。目前已有3种疫苗上市，分别是Gardasil(HPV6/11/16/18四价疫苗)，Gardasil9(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九价疫苗)和Cervarix(HPV16/18二价疫苗)，这些疫苗均是基于L1 VLP研制的，对HPV的防控和人类的健康起到了重要作用[6-7]。此外，HPV L1蛋白在病毒感染细胞初期具有重要作用，参与细胞表面受体的相互作用[8-9]。L2约占衣壳蛋白总量的20%，研究发现L2蛋白中存在许多广谱中和表位，具有发展为HPV广谱疫苗的潜力[10-11]；L2蛋白在病毒感染过程中发挥重要作用，其参与病毒感染的整个过程，包括吸附、内吞入胞、囊泡运输、入核和病毒复制[12]。因此，研究HPV衣壳蛋白的结构对HPV病毒学的研究具有重要意义，为进一步阐明HPV的颗粒组装机制、致病机理及感染机制及今后研发新一代HPV疫苗和开展HPV引起的疾病研究提供指导方向。本文拟就HPV衣壳蛋白结构生物学方面的研究进展作如下综述。

1 HPV衣壳蛋白结构研究进展

近年来，结构生物学发展极为迅速，多种研究手段被广泛应用于蛋白质的三维结构的解析，促进了HPV衣壳蛋白的结构研究。HPV L1五聚体晶体结构，L1 VLP、假病毒以及免疫复合物低温电镜结构的相继解析，初步阐明了HPV L1蛋白结构与功能的关系及VLP组装机制，对衣壳蛋白分子机制的研究及新一代HPV疫苗的设计具有重要的指导意义。

1.1 HPV L1结构研究进展

1.1.1 HPV L1五聚体晶体结构研究进展及现状：X-ray衍射技术广泛应用在蛋白质结构解析中，在结构生物学研究中占有重要地位。目前已通过X-ray衍射技术解析了HPV 11，16，18和35 L1五聚体晶体结构[13]。

2000年，陈小江等[14]首次解析了HPV16 L1 T=1 VLP的晶体结构，见图1。2007年又获得HPV16/18/11/35四个型别高分辨的五聚体晶体结构[13]，见图2。HPV五聚体晶体结构的解析，初步阐明了HPV衣壳蛋白结构与功能的关系，是L1蛋白研究中的一个重大突破。晶体结构解析结果显示，HPV16 L1蛋白的核心部分是由20～382氨基酸残基组成的类似“果冻卷”状β折叠桶，见图1。其中α螺旋用蓝色表示；β折叠用红色箭头表示；β转角或无规卷曲用紫色线条表示。

图中字母B到I表示β折叠桶中的各个片段，其中C、H、E、F和B、I、D、G β-折叠片段分别形成该结构中反向平行的2个片层，在各个β折叠片段之间存在无规则的柔性片段，其中的DE，FG和HI 3个loop较长并具有较大的柔性，明显突出于β折叠桶的表面。β折叠桶的N端1～20位伸出β折叠桶外，与五聚体形成相关，而C端还存在h1～h5 5个α螺旋结构。在HPV五聚体内部，L1单体间存在广泛的相互作用，5个L1蛋白分子紧密接触，结合形成14Å的中空的圆柱形五聚体，每个L1单体的β折叠桶为五聚结构的一“角”，并通过多肽骨架与相邻L1相互作用，这些相互作用如“搭扣”般紧密联系形成结构致密的五聚体。

图1 HPV16 L1五聚体晶体结构Fig. 1 The crystal structure of HPV16 L1 pentamer

HPV11、16、18和35四型五聚体晶体结构解析显示，四型HPV L1五聚体均与T=1 VLP的HPV16 L1五聚体结构极其相似，且HPV16 L1五聚体晶体结构的β折叠核心区和表面loop区的结构与T=1 VLP的HPV16 L1五聚体几乎完全重叠，但四型五聚体表面主要的loop区有着明显的构象差异，见图2。即使是同源性较高的HPV16和HPV35五聚体，其loop区也存在一定的差异。4个型别晶体结构显示每个型别的BC、DE、EF、HI和FG loop区均暴露在五聚体的表面。比较不同型别HPV L1蛋白氨基酸序列发现，L1蛋白中所有序列高变区均位于五聚体外表面的环状结构区域内，且大量研究表明这5个loop区是HPV中和表位的主要区域[15]。因此，结合HPV L1晶体结构提示loop区的差异决定着HPV型间的结构差异，并导致L1中和抗体的型特异性。

图2 HPV11、16、18和35四型五聚体loop区分析Fig.2 Loops comparison between HPV11/16/18/35 pentamers HPV16: blue (PDB: 2R5H); HPV18: violet (PDB: 2R5I); HPV11: green (PDB: 2R5K); HPV35: yellow (PDB: 2R5J)

然而，HPV11，16，18和35四型五聚体均是通过α4环缺失制备的，导致这些晶体结构无法反映 L1 α4环的结构。由于α4环的存在使五聚体容易聚集，无法获得均一的样品用于五聚体晶体培养，而解析高分辨的HPV VLP低温电镜结构可解决这一问题。

1.1.2 HPV L1 VLP低温电镜结构研究：低温电镜技术是对含水生物大分子进行快速低温到液氮或液氦温度(降温速率>104 ℃/s)，并在低温条件下采用低电子剂量成像，从而解析出高分辨的生物大分子三维结构。目前，低温电镜技术已广泛应用于HPV衣壳蛋白结构研究。早在1991年，Baker等[16]首次利用低温电镜和三维重构技术解析出HPV1和BPV1的低温电镜三维结构，结构显示HPV1和BPV1均为T=7约60 nm的内部含有核酸组蛋白核心的二十面体结构，2个病毒结构形态极其相似。三维结构显示，HPV病毒是由72个五聚体形成的T=7的二十面体结构，每个五聚体都是由5个L1单体聚合形成，不同五聚体之间是以五邻体或者六邻体的形式与其他壳粒相连。五邻体和六邻体的形态具有明显的差异，六邻体的亚单位之间联系紧密，五聚体之间的中心距离较短；五邻体的亚单位之间联系松弛，明显的相互分离，五聚体之间的中心距离较长。每个五邻体均和周围的六邻体相互作用。1997年，Trus等[17]解析出分辨率为9Å的BPV1低温电镜结构，该结构进一步揭示了BPV VLP中五邻体和六邻体的差异。Harrison等[18]在2010年解析了3.6Å的BPV1低温电镜三维结构，该高分辨率的结构已达到原子水平，显示出VLP内的部分组装信息。该结构揭示了L1的N端和C端如何和相邻的五聚体相互连接形成紧致的VLP：在T=7颗粒结构中，一个五聚体是通过β核心折叠区伸出一长段C端(氨基酸404～495)延伸至邻近的五聚体形成一个桥接结构，11个残基构成桥链。C端的氨基酸401～437从五聚体中延伸出并“侵入”相邻五聚体，其中426位保守的Cys与邻近五聚体EF环上保守的171位Cys形成二硫键，而氨基酸438～495又重新折回到原来β折叠核心区的位置，形成“侵入”和“折返”结构。HPV与BPV序列同源性较高、结构高度相似，因此，高分辨率BPV低温电镜结构所提供的组装信息对阐明HPV颗粒的组装机制具有重要参考意义。

1.1.3 HPV L1免疫复合物结构解析：低温电镜三维重构技术在研究生物大分子相互作用、生物大分子功能复合体和抗原抗体免疫复合物中具有重要的地位。1998年Booy等[19]首次利用低温电镜三维结构解析了13Å的BPV病毒与mAb#9和mAb 5B6的三维结构。结构显示2个抗体与BPV的结合方式完全不同，而结合方式的差异合理的解释了2者中和机制的差异。2014年Lee等[20]解析出10Å H16.V5 Fab复合物低温电镜三维结构。结构显示H16.V5 Fab与HPV16 VLPs上五邻体和六邻体的结合有明显差异，五邻体上H16.V5 Fab的电子密度较弱，这一原因可能是五邻体周围L1上的V5 Fab产生较大位阻，影响V5 Fab与五邻体的L1结合，导致在三维重构过程中这一区域的密度被弱化。Day等[21]研究发现抗体V5通过抑制HPV假病毒与细胞外基质中受体结合的方式阻碍病毒感染，然而V5抗体不阻碍假病毒与细胞膜表面的受体如硫酸乙酰肝素结合，这可能是因为V5抗体结合后残留的五邻体上一些氨基酸与硫酸乙酰肝素糖链结合造成的。Lee等在解析H16.V5 Fab复合物低温电镜三维结构过程中还发现，V5 Fab的结合引起HPV16 VLP构象变化，同时L1 C端充当“侵入臂”的结构更加牢固，并使五聚体之间更加紧凑，但构象变化的机制还需更高分辨力的结构才能进行阐述。

Guan等[22]在2015年成功解析了HPV16 L1抗体U4复合物的低温电镜三维结构，虽然分辨率较低，但三维结构可清晰的显示U4抗体与HPV16 VLP的结合方式：U4抗体只结合在五倍轴的顶点，每个VLP中含有60个U4，但U4抗体表位在L1的C端，理论上可与360个U4结合；该结构提示L1组装过程中C端可能发生构象变化，五邻体和六邻体周围L1的C端构象不同，或者是六邻体周围五聚体之间的空隙较小，不能容纳U4的结合，具体原因还需高分辨率的U4复合物低温电镜结构来解释。由于U4抗体的中和机制是阻碍假病毒与细胞膜结合，不阻碍假病毒与细胞外基质结合[21]，细胞膜上硫酸乙酰肝素与L1上BC、FG、HI loop和C端发生相互作用，而U4结合VLP后还剩余大量硫酸乙酰肝素和层黏连蛋白结合位点，因此U4抗体的表位与功能的关系还需进一步研究。

另外上述V5和U4免疫复合物的低温电镜三维结构分辨率较低，无法阐述V5和U4中和表位细节，因此需要解析高分辨的晶体结构或进一步提高免疫复合物的低温电镜三维结构分辨率，详细的阐明HPV L1中和抗体抗体的表位与功能的关系。

1.2 HPV L2结构研究进展 L2蛋白与L1蛋白一样，均作为结构蛋白参与病毒颗粒的形成[23]。虽然L2并不是VLP形成的关键蛋白，但在病毒感染、包裹基因组等环节中发挥重要作用。由于HPV L2蛋白的特殊性，L2在体外表达时构象折叠错误，致使蛋白可溶性较差，导致L2蛋白的晶体结构至今还未被解析。目前，关于HPV L2结构的报道只有2008年Buck解析的分辨率为20Å的HPV16假病毒结构[24]，该结构显示L2分布在L1形成的五聚体的背面，呈五星状排布，L1与L2的化学计量比为5:1；但由于分辨率较低，仍无法分辨L2的结构；但根据结构提示，L1与L2至少存在2个相互作用结构域，且L2分子间的相互作用很有可能与L2的疏水性相关；通过氨基酸突变分析获知L2蛋白上的一些功能区域如DNA结合区、NLS位点、弗林蛋白位点、细胞受体结合位点、动力蛋白结合位点等[24-26]。另外，大量研究表明L2蛋白N端含有广谱中和表位，该表位融合免疫后能诱导交叉中和抗体。因此解析HPV L2蛋白晶体结构或高分辨低温电镜三维结构对HPV病毒学研究和L2广谱疫苗研发具有重要意义。

2 HPV VLP组装研究进展

现有的HPV疫苗都是基于HPV L1 VLP研制的，VLP三维结构的解析有助于理解病毒颗粒的组装机制，但影响HPV VLP组装的因素众多，研究HPV VLP组装机制及影响VLP组装因素对HPV VLP疫苗研制具有重要意义。

HPV L1蛋白具有较强的自组装能力，研究表明，多种表达系统来源的L1蛋白在特定的条件下能自组装成VLP。研究发现，VLP的组装与多种因素有关，主要包括以下4个因素：①半胱氨酸和二硫键：二硫键在五聚体形成及72个五聚体形成正二十面体的过程中至关重要，Sapp等[28]于1995年首次证实经二硫苏糖醇(DTT)处理过的L1 VLPs可解聚成壳粒；另外研究进一步表明，在体外利用氧化剂促进半胱氨酸之间二硫键的形成将会促进五聚体组装成颗粒[29]。通过多个型别HPV L1蛋白序列的比对发现，HPV L1中含有大量半胱氨酸(Cys)，部分半胱氨酸具有高度的保守性且对VLP组装影响较大，通过对HPV16 L1蛋白上的Cys进行突变研究发现其中C175、C185和C428突变后影响HPV16 VLP组装，表明这些半胱氨基酸是VLP组装的关键氨基酸；Wolf等[18, 30]解析的T=7的BPV颗粒中C175和C428形成的二硫键能稳定VLP结构。因此，L1蛋白自组装的一个重要条件是局部氧化环境的形成。利用去除溶液中还原剂，添加适当的氧化剂等方法都可以促进L1蛋白的组装。②pH和离子强度：有研究表明较低的pH值(6～7)，与较高的离子强度也有助于VLP的形成[31]。③L1蛋白N端和C端长度：研究发现，当N端截断少于10个氨基酸时，不影响颗粒的组装，当N端截断至10个氨基酸时，只能形成T=1的“小”VLP，当N端截断至15个氨基酸时，则不能形成VLP；C端截断不超过30个氨基酸时对组装几乎没有影响，超过46个氨基酸则不能形成VLP；另外，L1 C端的h4环对VLP的形成至关重要，缺失后，L1只能形成五聚体，无法形成任何大小的VLPs[3,12,31]。④L2辅助组装：L1和L2蛋白共同组成HPV衣壳蛋白，L1在没有L2的情况下可自组装成与真病毒结构相似的VLPs，而单独的L2无自组装能力，但研究表明，L2不但可以结合DNA和L1，还具有辅助L1五聚体组装成VLP的功能，L2蛋白能促使不能形成VLP的L1突变蛋白形成VLP[34-35]。

3 HPV L1/L2相互作用研究进展

HPV病毒颗粒由L1和L2 2种蛋白组成，L2通过与L1相互作用嵌合在五聚体孔洞中，阐述L1和L2蛋白相互作用将促进HPV感染研究，深化人们HPV病毒学的认识。2008年Buck等[24]解析的分辨率为20Å的HPV16假病毒低温电镜结构，首次基本明确了HPV中L2蛋白的含量和分布，提示L1和L2间存在相互作用，但由于分辨率的限制，该结构无法解释L2如何巧妙的插入五聚体的内腔与L1相互协调组成完美的颗粒。后续进一步研究揭示L2的N端通过疏水相互作用与L1接触，L2的C端也与L1存在相互作用[36-37]。陈小江等[14]解析的HPV L1五聚体结构提示DE loop可能与L2蛋白存在相互作用，为了分析L1、L2相互作用关系及相互作用关键位点，Lowe等[38]通过模拟HPV L2结构，利用结构预测软件分析L1/L2相互作用区域，结果显示L1的DE、FG loop和C端与L2发生相互作用。Faust和Dillner在对中和抗体表位的研究中发现，位于BC、DE、FG和HI loop上的一些位点突变后会影响L2蛋白的结合和DNA的包裹，推测这些位点突变可能影响L1、L2的相互作用[39]。

综上所述，目前对于HPVL1/L2相互作用的研究比较片面，只有获得较高分辨率的HPV假病毒结构或L1/L2五聚体复合物的结构，才能更清楚的展开L1、L2相互作用的研究。

4 结语

近年来，结构生物学的快速发展使得人们对HPV衣壳蛋白结构与功能有了新的认识。HPV L1 T=1 VLP及五聚体晶体结构的解析阐明了HPV衣壳蛋白结构与功能的关系，并揭示HPV L1 loop区很可能是HPV血清型或组织特异性的分子基础，对HPV L1结构差异的研究及后续开发广谱疫苗具有重要的意义；HPV/BPV VLP及HPV假病毒低温电镜三维结构的解析对阐明HPV颗粒的组装机制具有重要的参考意义；免疫复合物结构的解析对阐明HPV病毒感染及抗体功能差异的研究提供了重要的参考依据。然而，至今仍有许多重要的问题没有解决，如L2蛋白的结构与功能、L1/L2蛋白相互作用关系、HPV颗粒的内部组装机制及HPV病毒的感染与致病机制等。这些问题的解决还需对HPV衣壳蛋白的结构进一步研究，如解析高分辨HPV L1免疫复合物结构晶体结构、L2蛋白的结构、L1/L2复合物结构、HPV假病毒及真病毒高分辨率低温电镜结构等。

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(编校：王冬梅)

Advances in structural biology of human papillomavirus capsid proteins

FAN Fei1, LIU Xin-lin1, LI Zhi-hai1, WANG Da-ning2, XIA Ning-shao1,2, LI Shao-wei1,2Δ

(1.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

Human papillomavirus (HPV) infection can induce several epithelial cancers, especially cervical cancer. HPV has a T=7 icosahedral capsid which is composed of L1 major capsid protein and L2 minor capsid protein. L1 protein has strong immunogenicity and can self-assemble into virus like particles (VLPs) which are structurally and immunologically similar to the native virions and have been considered as the ideal form of the current vaccine. In addition, both L1 and L2 proteins play an important role in viral infection. Therefore, study of the structures and the functions of the capsid proteins will help to elucidate the mechanisms of particle assembly, virus infection and pathogenesis, and provide insights for the research of HPV related diseases in the future. This review focuses on the research progress in structure, assembly conditions and the interaction of HPV capsid proteins.

human papillomavirus; capsid protein; structural biology

范飞，女，硕士在读，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：514412496@qq.com；李少伟，通信作者，男，博士，教授，研究方向：分子病毒学，E-mail: shaowei@xmu.edu.cn。

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10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.06