菟丝子提取物含药血清对人早孕滋养层细胞增殖及凋亡的影响

刘新玉，刘昱磊，罗颂平

(1.南方医科大学附属深圳妇幼保健院 中医科，广东 深圳 518038；2.广州中医药大学第一附属医院 妇产科，广东 广州 510405)

菟丝子提取物含药血清对人早孕滋养层细胞增殖及凋亡的影响

刘新玉1Δ，刘昱磊1，罗颂平2

(1.南方医科大学附属深圳妇幼保健院 中医科，广东 深圳 518038；2.广州中医药大学第一附属医院 妇产科，广东 广州 510405)

目的 探讨菟丝子提取物的含药血清对正常人早孕细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)增殖及凋亡的调节作用。方法 雌性SD大鼠随机分为8组，每组5只，包括空白血清对照组，减味寿胎丸组，菟丝子总提物高、低剂量组，菟丝子总黄酮高、低剂量组，菟丝子总多糖高、低剂量组，各组灌胃予对应药物，2次/天，连续3 d后腹主动脉采血分离血清。上述空白血清或各提取物血清以不同体积(5%、10%、20%)分别培养CTB细胞，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力，流式细胞仪分析细胞周期。结果 MTT结果显示，各提取物高、低浓度含药血清培养细胞48 h后，吸光度值均一定程度增加，除5%菟丝子总提物高剂量组及5%菟丝子总多糖低剂量组外，余各组5%、10%、20%含药血清与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。细胞增殖活性随含药血清浓度升高而增加，呈明显剂量依赖性。流式细胞仪分析结果显示，与空白血清组比较，各组S期细胞百分比均显著增加(P<0.05，P<0.01)；而G2/M期细胞百分比显著减少(P<0.05，P<0.01)。干预48 h后，细胞周期分布变化趋势与24 h一致，而且变化更明显。结论 菟丝子各提取物高、低剂量含药血清均可增加CTB细胞的增殖活性，降低细胞凋亡的发生。药效最佳剂量分别为：菟丝子总提物低剂量、总黄酮高剂量及总多糖高剂量。

菟丝子；细胞滋养层细胞；总提物；总黄酮；总多糖

寿胎丸是治疗先兆流产的基础方，大量临床及实验研究均已证实其补肾安胎的药效[1-2]。作为该复方的组成君药，菟丝子具有补肝肾、益精明目、固精缩尿、止泻安胎的功效。用于阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝酸软，肾虚胎漏，胎动不安等症。前期研究表明在降低肾虚流产模型大鼠的流产率，提高大鼠血清孕酮(P)及雌二醇(E2)水平、增加子宫蜕膜孕酮受体(PR)mRNA表达方面，寿胎丸复方中各单味药的贡献度依次为：菟丝子>桑寄生=续断>阿胶[3-4]，充分体现了菟丝子在该复方中的君药地位。前期动物实验研究证实菟丝子总提物及其有效部位提取物菟丝子总黄酮及总多糖均可降低流产模型大鼠的流产率，具有补肾安胎的作用[5]。细胞滋养层细胞是孕早期胚胎着床及正常发育最重要的细胞之一，其增值及凋亡活性直接影响到胚胎能否正常发育或发生自然流产，因此本研究拟运用中药血清药理学研究方法，以人早孕细胞滋养层细胞(CTB)模型为研究载体，研究寿胎丸君药菟丝子总提物、菟丝子总黄酮提取物及菟丝子总多糖提取物含药血清对CTB细胞增殖、分化潜能及凋亡的影响，以期初步研究菟丝子补肾安胎的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雌性SD大鼠40只，7～9周龄，体质量200～250 g，由广东省医学实验动物中心提供(合格证号：0088328)。

1.1.2 实验药物：减味寿胎丸复方成分菟丝子、桑寄生及续断三味药材，按原方比例药材购自广州中医药学第一附属医院中药房，经鉴定并按前期实验方法[5]提取鉴定后备用。结合动物药效实验结果及中药血清药理学研究方法，确定提取物的剂量。以下药物均以无菌0.9%NaCl溶液溶解，现用现配，用前摇匀。具体剂量及浓度见表1。

表1 菟丝子总提物及其有效部位化合物提取物不同组别剂量及浓度

1.1.3 试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Collagenase I、双抗(青霉素、链霉素)均为美国Gibico公司产品；MTT试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒为碧云天公司产品。

1.1.4 仪器与设备：1X70倒置系统显微镜带INFINITY全自动显微摄像头(OLIMPUS)；BIORAD550型酶标仪(Thermo SCIENTIFIC MULTISCAN MK3)；ALTRA EPICS型流式细胞仪(美国 BECKMAN COULTER 公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物含药血清的制备方法及步骤：大鼠随机分为8组，每组5只，包括：空白血清对照组(等量0.9%NaCl溶液灌胃)；减味寿胎丸组(1 g/kg剂量灌胃)；菟丝子总提物高、低剂量组(分别按临床成人等效剂量的5倍、1倍剂量灌胃，下同)；菟丝子总黄酮高、低剂量组；菟丝子总多糖高、低剂量组。每天灌胃给药2次，上下午各1次，连续3 d，末次给药前禁食不禁水12 h。所有大鼠于末次给药1 h后用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血约5 mL，静置4 h以上，1500 r/min离心10 min分离血清，56 ℃水浴锅中水浴30 min灭活，无菌超净台中经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，离心管分装并标记，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力：将原代培养的CTB细胞以1.5×104/mL的密度接种于96孔板，100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养48 h；去除培养液，加入无血清的DMEM/F12培养液，100 μL/孔，继续培养24 h，使细胞生长同步化。根据实验分组方案，将细胞分成8组，每组设5个复孔。分别加入5%、10%、20%的空白对照组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物高低剂量组、菟丝子总黄酮高低剂量组及菟丝子总多糖高低剂量组含药血清；再于对应孔中分别加入95、90、80 μL培养液，使每孔总体积100 μL；孵育48 h；每孔加入50 μL 1×MTT，孵育4 h；吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，培养板置于平板摇床震荡10 min使结晶物完全溶解；酶联免疫分析仪在490 nm波长处检测每孔的吸光度值(A值)。每组实验重复3次，取平均值。

1.2.3 细胞周期分析

① 细胞样品的准备：将生长同步化的细胞加入不同组别含药血清分别培养24、48 h；收集培养液至离心管内，0.25%胰蛋白酶消化，至细胞可被移液管吹打下来时，加入前面收集的培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，再次收集到离心管内；1000 r/min离心5 min沉淀细胞；吸出上清，加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移到离心管内，再次离心沉淀细胞；吸出上清，轻弹离心管底以免细胞成团。

② 细胞固定：加入1 mL预冷的70%乙醇，4 ℃过夜固定24 h； 1000 r/min离心5 min沉淀细胞；吸出上清，加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移到离心管，再次离心沉淀细胞并小心吸出上清，避免细胞成团。

③ 染色及流式检测和分析：每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，充分重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴30 min。流式细胞仪在490 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。流式细胞仪Muhicycle分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。以DNA含量为横坐标，受检细胞为纵坐标作图，用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。

2 结果

2.1 不同组别含药血清对细胞增殖活性情况的影响 与空白对照组血清相比，不同组别不同浓度含药血清培养细胞48 h后，吸光度值均有一定程度增加，与5%空白血清组比较，除菟丝子总提物高剂量组及菟丝子总多糖低剂量组差异无统计学意义外，余各组5%含药血清均差异有统计学意义(P<0.05)；与10%空白血清组比较，各组10%含药血清差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与20%空白血清组比较，各组20%含药血清差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。提示不同浓度的含药血清均可增加细胞的增殖活性。

各组不同浓度含药血清吸光度值比较，5%、10%、20%浓度的含药血清分别培养细胞48 h后，吸光度值均逐渐增加，显示细胞增殖活性随含药血清浓度升高而增加，呈明显剂量依赖性。其中空白对照组、减味寿胎丸组不同浓度间吸光度值差异无统计学意义；菟丝子总提物高、低剂量组、菟丝子总黄酮低剂量组及菟丝子总多糖高剂量组5%含药血清与20%含药血清吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)；菟丝子总黄酮高剂量组及菟丝子总多糖低剂量组5%含药血清与10%含药血清和20%含药血清吸光度值差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；各组20%含药血清吸光度值较10%含药血清均有一定程度增加，但差异均无统计学意义。见表2。

菟丝子各提取物组间比较，增强细胞增殖活性效果最好的组别分别为：总提物低剂量组、总黄酮高剂量组及总多糖高剂量组。

表2 不同组别不同浓度含药血清干预48 h后细胞吸光度值比较Tab.2 Comparison of the absorbance value of the cells after interfered with different groups of serum extraction at different concentrations(±s，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组比，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，与5%含药血清比，compared with 5%serum of extract

2.2 10%含药血清对细胞周期影响的分析 空白对照血清培养细胞24 h后, S期细胞数量较少，而不同组别提取物10%含药血清干预细胞24 h后，S期细胞百分比显著增加。与空白血清组比较，各组10%含药血清S期细胞百分比均差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；而不同组别提取物10%含药血清干预细胞24 h后， G2/M期细胞百分比较空白对照组显著减少(P<0.05，P<0.01)；与空白血清组比较，各组10%含药血清G1/G0期细胞百分比则差异无统计学意义。分别用空白对照血清及10%不同组别提取物含药血清培养细胞48 h后，细胞周期分布变化趋势与24 h一致，而且变化更加明显(P<0.05或<0.01)。见表3。

各组提取物含药血清组间比较，10%不同组别提取物含药血清培养细胞24 h及48 h后，S期细胞百分比菟丝子总多糖低剂量组与减味寿胎丸组比较差异有统计学意义(P<0.05)，余各组间比较差异无统计学意义。见表3。

菟丝子各提取物组间比较，对细胞周期分布影响效果最好的组别分别为：总提物低剂量组、总黄酮高剂量组及总多糖高剂量组。

表3 不同组别10%含药血清作用24 h及48 h后CTB细胞的周期分布Tab.3 Cell cycle distribution of the CTB cells after interfered with 10% serum in different groups(±s，%，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组比，compared with blank control group；△P<0.05，与减味寿胎丸组比，compared with Shoutaiwanjianwei group

3 讨论

菟丝子是寿胎丸的君药，其化学成分主要包括黄酮类、糖苷、氨基酸及微量元素，还有胆甾醇、芸苔甾醇、谷甾醇、豆甾醇及三萜酸类、生物碱、香豆素、鞣酸等化学成分[6]。其中黄酮类是其主要活性成分，其次为糖类物质。同时，菟丝子黄酮能改善心血管血流动力学， 有免疫增强作用，因此它和多糖成分可能都会对菟丝子的补益活性产生影响[7]。因此本研究以菟丝子总黄酮及总多糖提取物为研究对象。

滋养层细胞对胚泡的植入及胚胎的正常发育起重要作用。滋养层细胞又分为合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞(CTB)，前者是一个多核细胞体，位于绒毛膜表面，直接参与母体-胎儿之间物质交换，丧失了增殖能力，需要具有明显增殖能力的CTB细胞持续增生、融合以维持其功能。细胞增殖是细胞扩增及组织和器官发育的基础，在胚胎发育过程中起着至关重要的作用[8]。一旦此过程受到破坏或干扰，就会导致胚胎停止发育[9]。因此CTB细胞的增殖功能对妊娠维持至关重要。CTB细胞良好的增殖是胚胎正常生长的基础，正常早孕期CTB细胞的增殖能力很强，而反复自然流产、IUGR、先兆子痫等均伴有CTB细胞的增殖能力下降[10]。

王海燕等[11]探讨补肾益气方对正常早孕期人CTB细胞增殖、侵袭、分化等生物学行为的影响，采用MTT分析了不同浓度含药血清对CTB细胞活力的影响，发现含药血清培养的细胞在490 nm处的光吸收值明显高于空白对照组，且随着给药浓度增加，给药时间延长，这种作用更加明显，提示补肾中药增强生长中的正常早孕期人CTB细胞的活力。邢长英等[12]用灌服补肾益气方的大鼠血清处理体外培养的人CTB细胞48 h，可见人CTB细胞的增殖活力增强，且体积分数20%含药血清的作用高于10%含药血清(P<0.01)。提示补肾益气方不仅促进CTB细胞增殖活力, 并且在实验浓度范围内, 中药促增殖的作用随着药物浓度的增加而增强。马红霞等[13]研究菟丝子总黄酮对CTB细胞增殖能力的影响，结果提示菟丝子总黄酮呈时间和剂量依赖性增强早孕期CTB细胞活力，促进CTB细胞ERK1/2的磷酸化。推测菟丝子总黄酮可能是通过活化MAPK/ERK1/2信号通路促进CTB细胞增殖。

本研究结果亦表明菟丝子总提物、菟丝子总黄酮及菟丝子总多糖高、低浓度的含药血清均可增加细胞的增殖活性(P<0.05)。且细胞增殖活性随含药血清浓度升高而增加，呈明显的剂量依赖性(P<0.05)。各提取物不同剂量组对细胞增殖活性增加程度比较效果最好的分别为：菟丝子总提物低剂量组、菟丝子总黄酮高剂量组及菟丝子总多糖高剂量组。这表明作为菟丝子主要有效成分的总黄酮和总多糖物质均可增强CTB细胞的增殖活性，这可能与菟丝子作为寿胎丸复方的君药发挥补肾安胎药效有着密切关系。

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定的细胞主动死亡过程。早孕期CTB细胞以增殖为主，同时，正常妊娠亦存在一定程度的滋养层细胞凋亡[14]，且主要发生在合体滋养层细胞。在胚胎发育过程中，适度的细胞凋亡有利于绒毛内血管腔及分支形成。正常妊娠中滋养层细胞存在一定程度的凋亡，而流产患者的滋养细胞凋亡率则明显增多[15]。同时滋养层细胞的凋亡具有重要的生理和病理意义，因此进行滋养层细胞凋亡的研究具有重要的理论意义和临床价值。

王晟等[16]研究菟丝子总黄酮对无血清培养睾丸细胞所致凋亡的保护作用及其机制。采用流式细胞技术检测睾丸细胞亚二倍体凋亡，结果显示对照组的亚二倍体细胞含量几乎是高剂量组的2倍。表明菟丝子总黄酮对于生精细胞具有保护凋亡作用，菟丝子总黄酮具有抗氧化、清除氧自由基、抑制睾丸细胞凋亡的作用。

本实验研究表明各提取物10%含药血清分别培养细胞24 h后，S期细胞百分比均较空白对照组显著增加(P均<0.05，P<0.01)，G2/M期细胞百分比较空白对照组显著减少(P均<0.05，P<0.01)。提示10%含药血清培养细胞后，处于S期的细胞明显增多，阻滞在G2-M期细胞减少，表明含药血清可诱导细胞处于DNA合成期及有丝分裂期，促进细胞增殖，降低细胞凋亡的发生率。菟丝子各提取物组间比较，对细胞周期分布影响效果最好的组别分别为：总提物低剂量组、总黄酮高剂量组及总多糖高剂量组。

综上所述，本研究分别采用MTT法及流式细胞术用检测了CTB细胞的吸光度值及细胞周期中不同时期的细胞数，分析含药血清对细胞增殖及凋亡的影响，证实含药血清能促进细胞增殖，同时抑制细胞凋亡。结果提示：菟丝子总提物、菟丝子总黄酮及总多糖提取物高、低浓度的含药血清均可增加细胞的增殖活性。且细胞增殖活性随含药血清浓度升高而增加，呈明显剂量依赖性。10%含药血清培养细胞24、48 h后，处于S期的细胞明显增多，阻滞在G2-M期细胞减少，表明含药血清可诱导细胞处于DNA合成期及有丝分裂期，促进细胞增殖，降低细胞凋亡的发生率。菟丝子总提物、菟丝子总黄酮及总多糖提取物高低剂量组与减味寿胎丸组均能促进细胞增殖，降低细胞凋亡的发生率，这为菟丝子作为该复方的主要成分发挥治疗作用提供了参考依据，也为后续进一步研究菟丝子主要有效部位提取物的药效作用奠定了基础，但因为时间所限，本研究仅观察了菟丝子提取物对CTB细胞增殖及凋亡的影响，并未设置对照细胞作为参考，课题组成员后续进一步研究了减味寿胎丸及其有效成含药血清对人早孕蜕膜细胞凋亡的影响。结果显示减味寿胎丸及有效成分可不同程度抑制人早孕蜕膜凋亡[17]。提示该复方及其有效成分可能通过对CTB细胞及蜕膜细胞增殖凋亡同时产生影响而发挥补肾安胎药效，在此基础上目前本课题组在进一步深入研究减味寿胎丸含药血清对CTB细胞凋亡相关蛋白因子表达的影响，相关研究结果待进一步分析总结后发表。

[1] 丘春东,孔晓玲.寿胎丸治疗免疫因素所致复发性流产68例的临床观察[J].中国医药指南,2011,9(19):309.

[2] 何冬梅，尤昭玲，赖毛华，等.寿胎丸对反复自然流产小鼠母胎界面CD4+T细胞STAT信号转导途径的影响[J].中国中医药信息杂志，2010，17(1)：23-25 .

[3] 郜洁，罗颂平.肾虚黄体抑制大鼠流产模型补肾安胎药效的初步评价[J].内蒙古中医药，2011，30(13)：145-146.

[4] 郜洁，罗颂平.寿胎丸不同提取部位对肾虚流产模型孕鼠补肾安胎的药效学筛选[J].中药材，2011，34(8)：1251-1255.

[5] 刘新玉.菟丝子及其有效部位提取物补肾安胎药效研究[D].广州：广州中医药大学，2012.

[6] 郭洪祝，李家实.南方菟丝子化学成分研究[J].北京中医药大学学报，2000，23(3)：20-23.

[7] 章育中.南方菟丝子种子中醚不溶性树脂糖甙部分的成分[J].国外医学.中医中药分册[英]，1999，21(6)：280.

[8] Leno-Durán E, Ruiz-Magaa MJ, Muoz-Fernández R, et al.Human decidual stromal cells secrete soluble pro-apoptotic factors during decidualization in a cAMP-dependent manner[J].Hum Reprod， 2014，29(10):2269-2277.

[9] Wallace AE, Host AJ, Whitley GS, et al.Decidual natural killer cell interactions with trophoblasts are impaired in pregnancies at increased risk of preeclampsia[J].Am J Pathol,2013，183(6):1853-1861.

[10] 鲍粉红，赵可宁.封闭抗体不足性反复自然流产治疗研究[J].长春中医药大学学报，2012，28(5)：831-833.

[11] 王海燕, 归绥琪, 徐丛剑，等.补肾益气方对正常早孕期人细胞滋养层细胞生物学行为的影响[J].中国中西医结合杂志， 2004，24(6)：525-528.

[12] 邢长英，张德祥，滕银成，等.补肾益气方激活哺乳动物雷帕霉素靶分子(mTOR)通路影响人早孕细胞滋养层细胞生长[J].生殖与避孕，2009，29(9)：584-588.

[13] 马红霞，尤昭玲，刘华，等.菟丝子总黄酮对早孕期人细胞滋养细胞增殖能力的影响及其信号机制[J].中药材，2009，32(6)：939-943.

[14] Ishihara N，Matsuo H，Murakoshi H，et al.Changes in priliferative potentia1.apoptosis and Bcl-2 protein expression in cytotrophoblasts and syncytiotrohoblast in human placenta over the course of pregnancy[J].Endocr J，2000，47(3)：317-327.

[15] Cho SH，ChungKS，Choi JH，et al.CompoundK，ametabolite of ginseng saponin，induces apoptosis via caspase-8-dependent pathway in HL-60 human leukemia cells[J].BMC Cancer，2009,18(9)：449.

[16] 王晟，秦达念.菟丝子总黄酮对大鼠睾丸曲细精管无血清培养所致细胞凋亡的保护作用[J].中国药理学通报，2006，22(8)：984-987.

[17] 刘秀明.减味寿胎丸提取工艺及其有效成分的药动学和血清药理学研究[D].广州：广州中医药大学，2014.

(编校：王俨俨)

Effects of different extraction serum of semen cuscutae on cell proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells

LIU Xin-yu1Δ, LIU Yu-lei1, LUO Song-ping2

(1. Department of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518038, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)

ObjectiveTo observe the effects of serum of the different semen cuscuta extraction on proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells.MethodsThe female SD rats were randomly divided into 8 groups, 5 rats in each group, including blank control group, Shoutaiwanjianwei group, high and low dose of semen cuscuta total extract, high and low dose of semen cuscuta general flavones, high and low dose of semen cuscuta total polysaccharides, the rats in each group were administrated with corresponding drugs by gavage, twice daily, after consecutive treatment of 3 days, the blood samples were collected from abdominal aorta, then serum was separated.CTB cells were cultivated with serum of above blank control and different extracts at different volume(5%, 10%and 20%), the cell proliferation was detected by MTT and cell cycle was analysed by flow cytometry.ResultsMTT results showed,after treated with the high and low dose of drug containing serum for 48 hours, the optical density accelerated in a certain degree, the 5%, 10%and 20%of each group were significantly different from that of blank control group(P<0.05 orP<0.01)except for 5%high dose of semen cuscuta total extract and 5%low dose of semen cuscuta total polysaccharides.The proliferation increased with the concentration of serum dosage in an obvious dosage dependent tendency.The flow cytometry results showed, the percentage of S-phase were obviously accelerated than the blank group(P<0.05 or <0.01), while the percentage of G2/M phase were obviously reduced compared with blank group(P<0.05 or <0.01).Changes of 48h’s treatment were accordance with the 24 h’s with the more significant change.ConclusionHigh and low dose of serum semen cuscuta extracts could increase the proliferative activity of the CTB cells and reduce the apoptosis of the cells, the best ones are the low dose of semen cuscuta total extract, high dose of general flavones, high dose of total polysaccharides respectively.

semen cuscutae; cytotrophoblast; total extract; total flavonoids; total polysaccharides

国家自然科学基金面上项目(81273795)；广东省中医药局“建设中医药强省”科研项目(20152058)；广东省建设中医药强省专项资金项目([2015]102号)

刘新玉，通信作者，女，博士，主治医师，研究方向：自然流产的中医药防治，E-mail：liuxinyu0611@163.com。

R285

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.12