不同红色酿酒葡萄中多酚物质的差异性研究

周鹏辉，李　进，李泽福（中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司/山东省葡萄酒工程技术研究中心/山东省企业技术中心，山东蓬莱265608）

不同红色酿酒葡萄中多酚物质的差异性研究

周鹏辉，李进，李泽福
（中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司/山东省葡萄酒工程技术研究中心/山东省企业技术中心，山东蓬莱265608）

摘要：利用高效液相色谱检测蓬莱产区赤霞珠、品丽珠、小味儿多3种葡萄果皮与籽中15种单体酚和5种花色苷的含量。结果表明，3个品种的白藜芦醇含量基本一致；果皮中花色苷含量以小味儿多最高，赤霞珠与品丽珠基本一致；15种单体酚总量以小味儿多最高，品丽珠的最低。

关键词：酿酒葡萄； 小味儿多； 多酚物质； 白藜芦醇； 花色苷

多酚化合物（Polyphenol）是一类含有酚羟基的物质。由于其在植物分类、感官特性以及药理方面的重要性，成为业内研究最多的天然化合物之一［1］。许多研究实验证实，多酚物质具有较强的抗氧化作用，以及明显的抑菌、抗癌、抗老化和抑制胆固醇上升等功效，摄取一定量的多酚类物质能够有效地预防和抑制疾病的发生。因此，多酚类物质被称为人类健康的“第七营养素”［2-3］。在葡萄与葡萄酒学中，将多酚分为色素和无色多酚两大类，其中色素主要有花色素和黄酮两类，无色多酚主要分为酚酸（苯酸类和苯丙酸类）、聚合多酚（儿茶素和原花色素）及单宁（缩合单宁和水解单宁等）［4］。葡萄含有丰富的多酚类物质，主要分布在果皮和种籽中，红葡萄果皮中多酚主要有花色素类（如花色苷）、酚酸类（如咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等）、黄酮醇类（如槲皮素、堪非醇、杨梅黄酮等）、黄烷醇类（如儿茶素、表儿茶素等）及白藜芦醇，而葡萄籽中主要是儿茶素、槲皮素、原花青素、单宁等。

红色酿酒葡萄中多酚类物质对葡萄酒外观、收敛性、口感以及保健性能起到决定性作用，而不同酿酒品种间也存在着明显的差异。本研究选择蓬莱产区3个红色酿酒葡萄品种赤霞珠、品丽珠、小味儿多，采用HPLC技术以15种单体酚和5种花色素为标准，分析3个品种果皮和籽中花色苷、酚酸、黄酮醇类、黄烷醇类及白藜芦醇等多酚类物质的组成与含量的差异，以期为蓬莱产区品种适应性选择及不同品种的酿造技术提供科学的依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

选取蓬莱产区2014年成熟采收的赤霞珠、品丽珠、小味儿多3种酿酒葡萄，其采收期分别为10月8日、9月30日、10月15日，要求3种葡萄品种原料的树龄、架势、田园管理均一致。

主要试剂：乙腈为色谱纯；甲酸、甲醇等其他试剂为分析纯。

标准品：咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、没食子酸、香草酸、水杨酸、堪非醇、杨梅黄酮、儿茶素没食子酸酯（ECG）、表棓儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、白藜芦醇、锦葵色素-3-葡萄糖苷（MV）、飞燕草素-3-葡萄糖苷（DEL）、矢车菊素-3-葡萄糖苷（CYA）、芍药素-3-葡萄糖苷（PEO），均由Sigma公司生产；芦丁、槲皮素、儿茶素（CAT），均由中国药品生物制品鉴定所生产。

仪器：Agilent 1200液相色谱仪；旋转蒸发器、水浴恒温振荡器，为国产。

1.2分析方法

1.2.1样品前处理

取-20℃冷冻的葡萄，将皮、籽、肉分开，将皮和籽用液氮研磨，研磨后置于冰箱中备用。取冻干研磨后的葡萄样品1 g于提取液（丙酮∶水∶甲酸=80∶19∶1）中，料液比为1∶10（质量体积比）。每个葡萄样品的皮和籽各做3个平行样进行提取，记录每个平行称取样品的实际质量。将提取体系水浴振荡30 min后，离心取上清液。将皮和籽的提取液采用旋转蒸发仪蒸干，再用2 mL色谱级甲醇重溶，存放于-20℃下避光保存待分析。测定样品前需经0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.2.2单体酚测定色谱条件

AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（5μm，4.6×250mm），紫外检验波长为280 nm，柱温30℃，进样量10 μL，以峰面积外标法定量。梯度洗脱：流动相A：水-甲酸（98∶2，v/v），流动相B：乙腈，流速为1 mL/min。洗脱程序：0～7 min，B相为5%～10%；7～10 min，B相为10%～20%；10～15 min，B相为20%～30%；15～20 min，B相为30%～40%；20～30 min，B相为40%～50%；30～40 min，B相为50%～50%。

1.2.3花色苷测定色谱条件

Agilent Eclipse Plus C18（3.5 μm，4.6×100 mm），检验波长520 nm，柱温30℃，进样量5 μL，以峰面积外标法定量。梯度洗脱：流动相A：8%甲酸-水，流动相B：乙腈，流速1 mL/min。洗脱程序：0～10 min，B相为10%～15%；10～15 min，B相为15%～20%；15～20 min，B相为20%～30%；20～30 min，B相为30%～40%；20～35 min，B相为40%～50%。

2　结果与分析

2.1白藜芦醇含量差异性分析

白藜芦醇（Resveratrol，简称RES），分子式C14H12O3，相对分子质量228.25，存在顺式和反式2种结构，产生于葡萄表皮和浆果果皮中。作为葡萄酒的一种功效成分，其游离态和糖苷结合态，在顺式和反式2种形式时都具有抗氧化功能，是葡萄植株对真菌病害感染反应产生的一种重要的植物抗毒素，能够阻止低密度脂蛋白的氧化，因而具有潜在的防心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫调节作用［5］。在葡萄酒中的含量受酒种、葡萄品种、产地、栽培条件、发酵工艺等因素影响，存在较大差异，但一般认为红葡萄酒中含量大于白葡萄酒［6］。通过研究发现（图1），3个品种果皮与籽的白藜芦醇总量（干重，下同）基本一致，都在2.0～3.0 mg/kg范围内，但具体分布却差异较大：在籽中，小味儿多的含量最高，为1.5 mg/kg，而赤霞珠的含量最低，仅为0.6 mg/kg；果皮中含量正好相反，赤霞珠的最高，达到2.3 mg/kg，小味儿多的仅为0.8 mg/kg；品丽珠籽与果皮中含量差异不大，均在1.2 mg/kg左右。由此可知，在对该3种葡萄的酿造过程中，赤霞珠可通过前期低温浸渍果皮获得较多的白藜芦醇，而小味儿多则需在酒精发酵后通过加强对葡萄籽的浸渍来获得较多的白藜芦醇，品丽珠的工艺处理方式则应介于前2种葡萄之间。

图1　葡萄籽与果皮中白藜芦醇含量对比

2.2酚酸类单体酚含量差异性分析

葡萄浆果中的酚酸，包括羟基苯甲酸和羟基肉桂酸的衍生物，其中前者的衍生物包括五倍子酸、儿茶酸、香子兰酸和水杨酸，它们可与葡萄酒中的酒精和单宁结合；后者衍生物的含量较高，包括香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，常以糖、有机酸及各种醇的酯化形式存在于葡萄酒中［7］，在后期的酿造与陈酿过程中会缓慢水解一部分，所以在酒中常以游离和结合的形态存在。根据检测发现（图2和图3），标样的5种酚酸类单体酚在3种葡萄籽中均存在，总量以赤霞珠的最高，品丽珠的最低，但各种酸的含量差异较大，赤霞珠中阿魏酸的含量最高，为16.8 mg/kg，其次是13.6 mg/kg的香豆酸，没食子酸和水杨酸的含量较低，在0.5 mg/kg水平；品丽珠中香草酸的含量最高，为10.6 mg/kg，其余均较低，在1.5 mg/kg以下；小味儿多中水杨酸的含量最高，为12.3 mg/kg，其次是阿魏酸，为10.5 mg/kg，最低是咖啡酸，为0.5 mg/kg。而在葡萄果皮中，没食子酸仅存在于品丽珠中，且含量较低，而品丽珠中不含水杨酸，酚酸总量以小味儿多最高，赤霞珠最低，单体酚在品种间的差异仍较大，赤霞珠中香草酸含量最高，为11.3 mg/kg，品丽珠和小味儿多中都是阿魏酸含量最高，分别为22.5 mg/kg和34.7 mg/kg。

2.3黄酮醇类单体酚含量差异性分析

图2　葡萄籽中酚酸类单体酚含量

图3　葡萄皮中酚酸类单体酚含量

黄酮属于类黄酮化合物，与花色素统称为色素，其存在于所有品种葡萄的浆果中，分子结构中含有“黄烷构架”，可与糖苷结合，形成一个或多个糖的杂多糖苷［8］。因在葡萄酒中的含量较少，对其的研究认识也不多。实验以槲皮素、堪非醇、杨梅黄酮、芦丁4种黄酮醇类单体酚为标样进行研究发现（图4和图5），在葡萄籽中，赤霞珠和品丽珠仅含有杨梅黄酮和芦丁2种单体酚，且都是芦丁含量较高，而小味儿多除上述2种外，还含有1.4 mg/kg的堪非醇，仍是芦丁的含量最高，达到10.8 mg/kg；在葡萄果皮中，3种葡萄均不含堪非醇，赤霞珠和品丽珠仍是以芦丁含量最高，而小味儿多以4 mg/kg的杨梅黄酮含量最高，槲皮素与芦丁的含量稍低，在3.0 mg/kg水平。

图4　葡萄籽中黄酮醇类单体酚含量

2.4黄烷醇类单体酚含量差异性分析

葡萄酒中的聚合多酚为黄烷醇，可分为儿茶素（CAT）和原花色素两大类，都以衍生物或聚合物形式存在，可与糖结合成苷，也可与有机酸缩合成酯，如儿茶素没食子酸酯（ECG）、表棓儿茶素没食子酸酯（EGCG）。黄烷醇类是缩合单宁的前体，其中，儿茶素可通过聚合形成单宁［9］。在葡萄浆果或葡萄酒中，主要形成单宁。通过实验检测发现（图6和图7），黄烷醇类单体酚总量在所有酚类中含量最高，在葡萄籽中，赤霞珠的总量达到105.3 mg/kg、小味儿多的达到144.8 mg/kg；在葡萄果皮中，赤霞珠的总量与籽中基本一致，为104.6 mg/kg，品丽珠和小味儿多在70 mg/kg水平左右。而单体酚的含量差异较大，在葡萄籽中，赤霞珠以EGCG含量最高，达到73.6 mg/kg，其次是22.6 mg/kg的CAT，而EC和ECG的含量在4～6 mg/kg范围内；品丽珠以EC和EGCG的含量稍高，在6～8 mg/kg范围内，其余2种的含量在2 mg/kg以下；小味儿多也以EC和EGCG的含量高，CAT和ECG的含量低，但差异悬殊，前2种在70 mg/kg水平，后2种则在0.5 mg/kg水平。在葡萄果皮中，都是以CAT的含量最高，超过55 mg/kg，而赤霞珠和小味儿多的表现较为相似。综合分析，3种葡萄黄烷醇类单体酚的含量可在化学层面解释其不同单品种葡萄酒陈酿潜力差异的原因。

图5　葡萄皮中黄酮醇类单体酚含量

图6　葡萄籽中黄烷醇类单体酚含量

2.5葡萄皮中花色苷含量差异性分析

花色素与糖苷形成花色苷，存在于葡萄果皮中，在酿造过程中经过浸渍和发酵工艺而进入葡萄酒中，并可与乙醇、香豆酸、咖啡酸等结合成酰化花色苷，色调、色度都会发生明显的变化［10］。在浸渍及发酵初期，果皮中部分单体花色苷进入酒中，颜色呈鲜艳的紫红色，发酵及陈酿过程中逐渐聚合形成聚合花色苷，使葡萄酒的颜色逐渐变为砖红色。在欧亚种葡萄及葡萄酒中，花色苷主要包括5种花色素形成的糖苷及其衍生物：飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、芍药素、锦葵花素，其中以锦葵花素为主，也最为稳定，飞燕草素最不稳定［11］。葡萄及葡萄酒中花色苷的含量及比例直接影响葡萄酒的色度、色调及化学稳定性。实验检测发现（图8），3种品种中，以小味儿多的花色苷总量最高，达32.75 mg/g，赤霞珠和品丽珠基本一致，在15.3 mg/g水平；3种均是锦葵花素的含量最高，与前人研究一致，仍以小味儿多的最高，其次都是芍药素的含量次之，然后是矮牵牛素；赤霞珠和小味儿多2种葡萄中不含矢车菊素，而品丽珠都含有这5种花色苷。

图7　葡萄皮中黄烷醇类单体酚含量

图8　葡萄皮中花色苷含量

3　结论与讨论

多酚和单宁类物质是葡萄酒存在差异的主要原因之一，决定着葡萄酒风味的优劣，影响着葡萄酒的生物化学稳定性［12］。本研究针对蓬莱产区赤霞珠、品丽珠、小味儿多3个红色酿酒葡萄果皮和籽中15种单体酚和5种花色素进行对比测定，结果表明：

（1）3个品种白藜芦醇总量基本一致，但赤霞珠果皮中的含量最高，小味儿多的籽中含量最高，品丽珠中两者基本持平。

（2）3个品种的15种单体酚总量以小味儿多最高，品丽珠的最低，而葡萄籽中以小味儿多的最高，品丽珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品丽珠的最低。其中，酚酸类总量以小味儿多最高，品丽珠的最低，而葡萄籽中以赤霞珠的最高，品丽珠的最低；果皮中以小味儿多的最高，赤霞珠的最低。黄酮醇类总量以小味儿多最高，品丽珠的最低，而葡萄籽中以小味儿多的最高，赤霞珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品丽珠的最低。黄烷醇类总量以小味儿多最高，品丽珠的最低，而葡萄籽中以小味儿多的最高，品丽珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品丽珠的最低。

（3）3个品种果皮中花色苷总量以小味儿多最高，赤霞珠与品丽珠基本一致。

（4）对于赤霞珠葡萄来说，果皮与籽中多酚含量基本一致，都在140 mg/kg水平，建议在酿造过程中应同时注意加大前期浸渍和后浸渍两个工艺，以获得果皮与籽中较高的酚类物质，而对于小味儿多来说，葡萄籽中多酚含量高于果皮，建议加强后浸渍工艺，以获得籽中的多酚物质；对于品丽珠来说，因为果皮中酚类物质较高，故建议加强前期对果皮的浸渍，以获得果皮中的多酚。

（5）通过本研究，可以有效考察蓬莱产区不同红色酿酒葡萄浆果中不同部位多酚物质的含量与差异，为产区内酿酒葡萄质量的评估及酿造工艺的选择提供参考。

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优先数字出版时间：2016-04-01；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160401.1346.006.html。

中图分类号：TS262.6；TS261.7；S663.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0055-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016053

收稿日期：2016-02-23

作者简介：周鹏辉（1987-），男，河南周口人，助理工程师，大学本科，主要从事葡萄酒酿造相关的研究，E-mail：zhouph1987@126.com。

The Difference in Polyphenols in Red Wine Grape of Different Species

ZHOU Penghui，LI Jin and LI Zefu
（COFCO Greatwall Winery（Yantai）CO.Ltd.，Shandong Provincial Grape Wine Engineering Research Center，Shandong Provincial Enterprise Technology Center，Penglai，Shandong 265608，China）

Abstract:The content of 15 kinds of free phenol and 5 kinds of anthocyanins in grape peel and grape seed of three kinds of red wine grape including Cabernet Sauvignon，Cabernet Franc and Petit Verdot in Penglai regions was measured by HPLC.The results suggested that，all the three kinds of wine grape had almost the same content of resveratrol，Petit Verdot had the highest content of anthocyanins in grape peel（Cabernet Sauvignon had almost the same content of anthocyanins as Cabernet Franc），and the total content of 15 kinds of free phenol was the highest in Petit Verdot and the lowest in Cabernet Franc.

Key words:wine grapes；Petit Verdot；polyphenols；resveratrol；anthocyanins