雷帕霉素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

尹菲菲，刘卫红，李冬梅，梅繁勃



雷帕霉素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

尹菲菲，刘卫红，李冬梅，梅繁勃

中国武警总医院(北京 100039)

摘要：目的探讨雷帕霉素(RPM)对心肌缺血再灌注(MI/R)损伤的保护作用。方法采用结扎左冠脉前降支30 min再灌注120 min的方法复制MI/R损伤大鼠模型，分为假手术组、模型组、RPM组(5 mg/kg)，于术前3 d开始灌胃给药。试验结束时取血清，测定肌酸激酶(CK)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；取心脏，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色后测定心肌梗死面积。结果RPM可明显缩小MI/R损伤大鼠的心肌梗死面积，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；RPM可显著降低血清CK和LDH活性，与模型比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，RPM组血清SOD活性显著升高，血清MDA含量则明显降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论RPM预处理可抑制脂质过氧化反应，有效改善MI/R心肌的氧自由基损伤。

关键词：心肌缺血再灌注损伤；雷帕霉素；肌酸激酶；乳酸脱氢酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion， MI/R)损伤是一个复杂的病理生理过程，其损伤程度可决定缺血性心脏病的治疗和预后[1]，目前对于MI/R损伤的防治尚无突破性研究进展。雷帕霉素(rapamycin， RPM)是一种新型大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制作用，临床上常用于自身免疫性疾病和器官移植后排斥反应的治疗[2]。近年研究证实，RPM对缺血再灌注动物的肝、肾、脑等器官损伤具有一定的保护效应[3-5]。本研究应用MI/R损伤大鼠模型，探讨RPM的心肌保护作用及其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠，雌雄各半，体重200 g± 20 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2药品和试剂RPM购自Sigma公司，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成所需浓度。氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride， NBT)、肌酸激酶(creatine kinase， CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase， LDH)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。

1.3实验方法1.3.1建立MI/R损伤模型采用冠脉结扎法建立MI/R损伤模型[6]。取大鼠，术前12 h禁食不禁水，戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部分离气管，插入气管插管，连接DW-3000型动物人工呼吸机(呼吸频率60次/min，潮气量2 mL/100 g)。顺肋间隙方向于胸骨左旁第3、4肋间开胸，分别在第3、4肋上环绕1根0号手术线，牵拉手术线使肋骨撑开，暴露心脏，沿左心耳下缘冠脉前降支起始部3 mm～4 mm处用4-0带线缝合针穿过，进针深度控制在0.1 cm左右，将一小段直径1.5 mm的乳胶管置于结扎线下，收紧结扎线以造成心肌缺血，约30 min后(冠脉结扎成功的标志：心电图ST段明显抬高或T波高耸)，松开结扎线再灌注120 min(再灌注成功的标志：抬高的ST段下降50%以上或高耸的T波下降)。结扎前心电图不正常者，未到观察终点而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分组与给药方法将成模大鼠随机分为模型组和RPM组，每组10只。另取10只大鼠，开胸但不结扎冠脉，作为假手术组。各组于术前3 d开始灌胃给药，每天1次，RPM组剂量按5 mg/kg，假手术组和模型组给予等体积0.5% CMC-Na。

1.3.3血清指标的测定再灌注结束后，各组动物由股动脉采血，3 500 r/min离心10 min得血清，采用比色法测定CK活力和LDH活性，羟胺法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，操作按试剂盒说明书进行。

1.3.4心肌梗死面积测定取血后处死大鼠，迅速摘取心脏，用PBS缓冲液冲洗干净，滤纸拭干，去除心房、血管及脂肪组织，在冠脉结扎线下，从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌则呈蓝色，用数码相机进行图像采集，导入电脑，通过图像分析软件ImagePro Plus 7.0测算梗死区面积和心室总面积，计算心肌梗死面积(%)[7]。

2结果

2.13组心肌梗死面积比较模型组大鼠心肌梗死面积31.65%，RPM可使心肌梗死面积缩小至26.00%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1　3组心肌梗死面积比较(±s)

2.23组血清CK活力和LDH活性比较心肌缺血30 min再灌注120 min后，模型组大鼠血清CK活力和LDH活性比假手术组明显升高，组间差异均有统计学意义(P< 0.01)；RPM组可显著降低血清CK活力和LDH活性，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2　3组血清CK活力和LDH活性比较(±s)

2.33组血清SOD活性和MDA含量比较心肌缺血30 min再灌注120 min后，模型组大鼠血清SOD活性比假手术组显著降低，MDA含量则比假手术组明显升高(P<0.01)。RPM组血清SOD活性显著升高，而MDA含量显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

表3　3组血清SOD活性和MDA含量比较(±s)

3讨论

药物预处理可通过促使机体释放生物活性物质或直接激活保护机制而增强心脏对缺血、缺氧的耐受，实现对缺血再灌注所致心肌损伤的保护作用[8]。本研究采用缺血前给药的方式观察RPM预处理对MI/R损伤的保护作用，结果显示RPM能显著缩小心肌梗死面积，与模型组比较差异有统计学意义(P< 0.05)。MI/R发生时心肌酶如CK、LDH等的释放量增加，其释放入血的多少被认为与心肌坏死程度呈正相关[9]，因此，测定血清心肌酶活性可作为MI/R损伤程度的诊断标准之一。本研究结果表明：RPM预处理可显著抑制血清CK活力和LDH活性(P<0.05或P< 0.01)，进一步说明RPM的心肌保护作用。

MI/R时经由各种途径生成大量的氧自由基，堆积的氧自由基使生物膜发生脂质过氧化反应，导致生物膜的结构遭到破坏、功能受损，使离子转运、生物能的产生和细胞器的功能发生一系列病理生理改变，从而加剧缺血心肌的组织损伤及功能障碍[10-11]。MDA作为氧自由基与生物膜发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量变化反映了机体内脂质过氧化的程度，从而间接反映心肌损伤的程度。SOD是机体内主要的抗氧化酶-超氧自由基清除剂，其活性高低代表了组织清除自由基的能力，研究证实外源性SOD对动物MI/R损伤有保护作用[12]。本研究观察RPM对MI/R损伤大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响，结果显示与假手术组比较，模型组血清SOD活性降低、MDA含量升高，进一步证实自由基与MI/R损伤密切相关；RPM能减少机体MDA的生成、保护SOD的活性，提示RPM预处理可抑制脂质过氧化反应，增加氧自由基清除能力，实现对MI/R心肌损伤的保护作用。

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(本文编辑薛妮)

基金项目：国家自然科学基金(No.81102870)

通讯作者：梅繁勃，E-mail：meifanbo@126.com

中图分类号：R542.2R256.2

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．12．009

文章编号：1672-1349(2016)12-1337-03

Corresponding Author：Mei Fanbo

(收稿日期：2015-10-30)

The Influence on Rapamycin Management Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

Yin Feifei，Liu Weihong，Li Dongmei，Mei Fanbo

General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of rapamycin (RPM) on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury in rats.MethodsRat model of MI/R injury was prepared by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.Then rats were divided into 3 groups at random (n=10)，namely sham，model，RPM group (5 mg/kg).RPM was administered by intragastric gavage once a day for 3 days pre-operation.The creatine phosphokinase (CK)，lactate dehydrogenase (LDH)and superoxide dismutase (SOD)activities，and the contents of malondialdehyde (MDA)in sera were examined， and the area of myocardial infarction was calculated after the reperfusion.ResultsRPM significantly reduced the area of myocardial infarction， compared to that of model group (P<0.05).The CK and LDH activities in RPM group were significantly lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01).RPM evidently elevated the SOD activity (P<0.01)， and reduced the MDA contents in sera (P<0.01).Conclusion The effectiveness of RPM pretreatment in MI/R injury appears to be associated with the inhibition of lipid peroxidation.

Key words：rapamycin;myocardial ischemia/reperfusion injury；creatine phosphokinase；lactate dehydrogenase；superoxide dismutase；malondialdehyde