草苁蓉多糖对过氧化氢损伤HepG2细胞NF-κB表达的影响

尹学哲　王玉娇　尹基峰　全吉淑

(延边大学附属医院，吉林　延吉　133000)



草苁蓉多糖对过氧化氢损伤HepG2细胞NF-κB表达的影响

尹学哲王玉娇1尹基峰全吉淑1

(延边大学附属医院，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探讨草苁蓉多糖(BRPS)对过氧化氢(H2O2)损伤的HepG2细胞核转录因子(NF)-κB表达的影响。方法以HepG2细胞为研究对象，通过H2O2诱导细胞氧化应激损伤模型，采用蛋白印迹法检测NF-κB、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、血红素氧合酶(HO)-1、环氧化酶(COX)-2以及核因子-E2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。结果H2O2损伤HepG2细胞后，NF-κB p65和Nrf2蛋白水平升高，iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高。BRPS处理可降低HepG2细胞NF-κB p65水平，对Nrf2蛋白水平无显著影响。BRPS同时降低iNOS、HO-1蛋白水平，但对COX-2蛋白水平无影响。结论BRPS降低H2O2损伤的HepG2细胞iNOS、HO-1蛋白水平，这可能与降低NF-κB活化有关。

〔关键词〕草苁蓉多糖；过氧化氢；氧化损伤；HepG2；核转录因子-κB

核转录因子(NF)-κB参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等病理生理过程的基因调控〔1〕，其与肝细胞损伤的关系一直是肝脏疾病研究中的热点〔2〕。研究证实，急性肝损伤时伴随着NF-κB的活化，通过NF-κB通路激活肝脏Kupffer细胞，从而造成肿瘤坏死因子(TNF)-α和Fas等基因表达上调，导致肝细胞炎症，诱发肝细胞凋亡，造成肝功能损害〔2〕。草苁蓉又名不老草，具有补肾壮阳、滋补强身、润肠止血、延年益寿的功效，具有抗脂质过氧化、增强免疫、抗炎及抗肿瘤等作用〔3～5〕。草苁蓉多糖(BRPS)是草苁蓉重要活性成分，前期研究发现其对过氧化氢(H2O2)所致HepG2细胞氧化应激具有抑制作用，减轻其细胞损伤〔6〕。本实验拟探索BRPS对损伤HepG2细胞NF-κB及下游炎性蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1药物与试剂BRPS：醇沉法提取，含量70%〔6〕。人HepG2细胞：南京凯基生物有限公司；DMEM培养基及小牛血清：Gibco公司；兔NF-κB多克隆抗体、兔诱导型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗体、小鼠血红素氧合酶(HO)-1单克隆抗体、兔环氧化酶(COX)-2多克隆抗体、兔核因子-E2相关因子2(Nrf2)多克隆抗体：美国Abcam公司。

1.2主要仪器3-30K型离心机,Sigma公司；DYY-12型电泳仪、DYCP-31D型电泳槽、DYCZ-24DN型电泳仪，北京六一仪器厂；Trans-Blot转印槽，美国Bio-Rad公司；UVP凝胶成像分析仪，美国UVP公司。

1.3细胞培养及分组〔5,6〕HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下静置培养，细胞铺满瓶底80%以上，取对数生长期增殖活跃的细胞进行分组。对照组换入正常培养液；加入H2O2，使其浓度为300 μmol/L；BRPS组中加入BRPS使其浓度达到50 mg/L，2 h后再加入300 μmol/L H2O2诱导损伤12 h〔5,6〕。

1.4蛋白印迹法检测NF-κB以及相关炎性蛋白的表达收集并裂解细胞，提取总蛋白，以20 μg蛋白为上样量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移至聚偏乙烯(PVDF)膜上。封闭后，一抗孵育过夜，然后用相应二抗耦联物反应1 h，增强化学光法(ECL)显迹，在凝胶成像分析仪中采集图像并进行灰度分析。

2结果

2.1BRPS对氧化损伤HepG2细胞NF-κB和IκB蛋白表达的影响与对照组比较，H2O2组HepG2细胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05)；与H2O2组比较，BRPS组HepG2细胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05)。见图1。

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下图同图1　BRPS对氧化损伤HepG2细胞NF-κB和IκB蛋白表达的影响

2.2BRPS对氧化损伤HepG2细胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表达的影响与对照组比较，H2O2组HepG2细胞iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高(P<0.05)；与H2O2组比较，BRPS组iNOS、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，COX-2蛋白水平无显著变化(P>0.05)。见图2。

图2　BRPS对氧化损伤HepG2细胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表达的影响

2.3BRPS对氧化损伤HepG2细胞Nrf2蛋白表达的影响与对照组比较，模型组细胞核Nrf2蛋白含量增高(P<0.05)；BRPS处理对细胞核Nrf2蛋白含量有增高趋势，但无显著差异(P>0.05)。见图3。

图3　BRPS对氧化损伤HepG2细胞Nrf2蛋白表达的影响

3讨论

H2O2是一种非常活跃的强氧化剂，能引发一系列的氧化反应进而影响甚至破坏细胞的正常新陈代谢，产生氧化应激，造成细胞损伤；同时产生一系列自由基，激活细胞内转录因子NF-κB，从而介导细胞炎症和凋亡，加重细胞损伤〔7〕。NF-κB是一种具有多向转录调节作用的蛋白因子，活性氧可以直接激活NF-κB；活化的NF-κB即可进入细胞核，诱导靶基因的转录，促进各种炎症介质释放而导致细胞损伤〔8〕。因此，NF-κB途径被认为是炎症信号传导的关键〔8〕。本研究发现，H2O2刺激可引起肝细胞NF-κB蛋白活化，使其核转移增强，导致其下游相关炎性因子iNOS、HO-1、COX-2蛋白表达上调。说明NF-κB激活可使肝细胞炎症相关靶基因表达上调，导致肝细胞炎症，造成肝功能损害。而BRPS处理可降低肝细胞NF-κB活化，核转移减少，下调iNOS和HO-1蛋白表达，从而降低细胞炎症和损伤。在本研究中，BRPS对肝细胞COX-2蛋白表达无显著影响，是否还存在其他因素影响COX-2表达还有待研究。此外，HO-1的表达受多种信号途径的共同调控〔9〕。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，对HO-1具有重要的调节作用〔9〕。本研究发现，H2O2损伤HepG2细胞核Nrf2蛋白水平升高，但BRPS对核Nrf2蛋白水平无显著影响。提示，BRPS下调HO-1蛋白表达可能是由NF-κB介导的，与Nrf2无关。

综上所述，BRPS能够抑制肝细胞NF-κB活化和核转移，使其介导的炎症相关的靶基因表达下调，这有助于其降低细胞炎症和细胞损伤。

4参考文献

1赵外欧，李相军.NF-κB参与银杏叶提取物保护血管内皮细胞的作用〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(1):178-9.

2陶立德，薛同敏，张杰，等.缺血预处理对大鼠缺血再灌注肝组织NF-κB表达、炎症及氧化应激反应的影响〔J〕.中国普通外科杂志，2015；24(1):70-4.

3汪霞，周微，李天，等.草苁蓉环烯醚萜对肝癌前病变大鼠血清标志酶及抗氧化活性的影响〔J〕.食品科技，2010,35(7):242-5.

4Quan JS,Jin MH,Xu HX,etal.BRP,a polysaccharide fraction isolated from Boschniakia rossica,protects against galactosamine and lipopolysaccharide induced hepatic failure in mice〔J〕.J Clin Biochem Nutr,2014；54(3):181-189.

5尹学哲，王玉娇，尹基峰，等.草苁蓉提取物对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用〔J〕.食品科学，2015,36(15):173-8.

6王玉娇.草苁蓉多糖对肝细胞氧化损伤的保护作用〔D〕.延吉；延边大学，2014.

7张祎，陈文，孟宪丽.三黄泻心汤对全脑缺血再灌注大鼠氧化应激及炎性损伤的保护作用〔J〕.中药药理与临床，2014；30(4):1-5.

8龙石银，崔慧辉，张彩平，等.二苯乙烯苷对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞核因子κB、肿瘤坏死因子α表达的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志，2010；28(7):510-3.

9刘丹，李冰，董丹丹，等.无机砷对肝细胞转录因子Nrf2及其调控蛋白表达影响〔J〕.中国公共卫生，2012；28(9):1188.

〔2015-12-17修回〕

(编辑袁左鸣)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160539；81360651)

通讯作者：全吉淑(1968-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事中药药理学研究。

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3108-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.007

Effect of Boschniakia Rossica polysaccharides on expression of NF-κB in H2O2-damaged HepG2 cells

YIN Xue-Zhe,WANG Yu-Jiao,YIN Ji-Feng,et al.

Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of polysaccharides from Boschniakia rossica(BRPS)on expressiion of nuclear factor(NF)-κB in H2O2-damaged HepG2 cells.MethodsThe protein expressions of NF-κB, inducible nitric oxide synthase(iNOS), heme oxygenase(HO)-1, cyclooxygenase(COX)-2 and nuclear factor erythroid2-related factor 2(Nrf2)were determined by Western blot. ResultsDuring the oxidative damage, nuclear levels of NF-κB p65 and Nrf2 proteins were increased, and the protein expressions of iNOS, HO-1 and COX-2 were up-regulated. The administration of BRPS reduced the nuclear NF-κB p65 level while there was no significant change of Nrf2 protein. BRPS also down-regulated the protein expressions of iNOS and HO-1, but had no significant effect on COX-2. ConclusionsBRPS could reduce the levels of iNOS and HO-1 proteins, probably via the reduction of NF-κB activation.

【Key words】Boschniakia rossica; H2O2; Oxidative damage; HepG2; NF-κB

1延边大学医学院

第一作者：尹学哲(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药药理学研究。