子宫内膜癌患者外周血调节性T细胞的检测及临床意义

李莉 楼寒梅

子宫内膜癌患者外周血调节性T细胞的检测及临床意义

李莉 楼寒梅

目的 分析子宫内膜癌患者外周血 CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（Treg）水平及其在肿瘤免疫耐受中的作用。方法 选择2012年8月至2014年8月子宫内膜癌患者82例为观察组，健康志愿者30例为对照组，采用流式细胞仪检测外周血中CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞的比例，分析其与肿瘤分期、分化程度和年龄的关系。结果 子宫内膜癌患者CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞比例为（4.89±1.42）%，显著高于健康对照组（3.34±0.84）%。不同分期、不同分化程度及不同年龄子宫内膜癌患者的CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞比例差异无统计学意义。结论 子宫内膜癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞比例明显升高，可能参与子宫内膜癌免疫耐受。

子宫内膜癌 调节性T细胞 外周血 流式细胞术

肿瘤的发生、发展与肿瘤免疫耐受密切相关。CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（Treg）是近年发现的一群特殊的具有免疫调节功能、维持抗原特异性T细胞耐受的T淋巴细胞亚群，由于其具有免疫调节功能被称为调节性T细胞。少量Treg就可以抑制绝大多数类型的免疫反应，不仅能抑制自身免疫性疾病的发生，还在肿瘤免疫中发挥重要的调节作用［1］。研究认为多种恶性肿瘤患者的外周血和肿瘤局部，Treg数目增加，且Treg数量与肿瘤的严重程度呈负相关［2～4］。作者采用流式细胞术检测子宫内膜癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg调节性T细胞水平并探讨其临床意义。

1　 临床资料

1.1 一般资料 2012年8月至2014年8月在本院接受手术治疗的子宫内膜癌患者82例为观察组，年龄32～70岁，平均年龄53.65岁。所有患者均有明确的病理诊断，未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗，＜3个月未曾使用免疫增强或免疫抑制剂，其病理类型均为腺癌。按FIGO2009子宫内膜癌分期标准进行手术病理分期：I期59例、II期8例、III期15例。高分化17例、中分化42例、低分化23例。选择同期本院体检的健康女性30例为对照组，年龄28～65岁，平均年龄49.58岁。

1.2 主要试剂 PC5标记的鼠抗人CD4抗体、PE标记的鼠抗人CD127抗体、PE标记的鼠抗人CD8抗体，FITC标记的鼠抗人CD25抗体及同型对照均购自美国贝克曼库尔特公司。FC500MCL型流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司生产。

1.3 流式细胞仪分析 两组成员均于清晨空腹抽外周静脉血2ml，EDTA抗凝。取不同免疫荧光标记的单克隆抗体各20μl分别加入100μl外周血中，室温下孵育15min，加入红细胞裂解液，孵育15min，PBS洗涤2次，上机检测，Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异性对照值。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　 结果

2.1 子宫内膜癌患者与对照组外周血CD4+CD25+CD127-Treg比例比较 82例子宫内膜癌组外周血 CD4+CD25+CD127-Treg占 CD4+T细胞比例为（4.89±1.42）%，30例对照组健康女性外周血CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细 胞 比 例 为（3.34±0.84）%。子宫内膜癌组外周血Treg比例明显升高，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组外周血Treg占CD4+T细胞比例比较

2.2 不同临床病理因素子宫内膜癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg比例分析 82例子宫内膜癌患者按分期、分化程度及年龄分层，外周血CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞比例组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理因素子宫内膜癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg比例

3　 讨论

肿瘤的发生是肿瘤生长及侵袭能力由弱至强，而机体免疫功能由活跃至沉默的一种此消彼长的过程，肿瘤的发生、发展、治疗、预后等均与机体的免疫功能密切相关［5］。子宫内膜癌作为一种实体肿瘤，其发展过程亦有此特点。子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的身心健康。其发生率为女性生殖器官恶性肿瘤的第3位。随着全球妇女人均寿命延长，雌激素替代治疗日益增多等因素，子宫内膜癌的发生率呈上升趋势，甚至在部分发达国家，子宫内膜癌发病率位居妇科恶性肿瘤的首位。近年来，我国子宫内膜癌发病率也呈逐年升高趋势，且发病率呈年轻化倾向。因此，探索子宫内膜癌免疫耐受的相关机制有助于为子宫内膜癌的预防及免疫治疗提供新的思路。

调节性T细胞是近年发现的一种在肿瘤免疫耐受中发挥重要作用的调节细胞，少量的Treg就可以抑制绝大多数类型的免疫反应，不仅能抑制自身免疫性疾病的发生，还在肿瘤免疫中发挥重要的调节作用。Foxp3是Treg细胞特异性表达的转录因子，是公认的Treg细胞的特异性分子标记，一般情况下提到的调节性T细胞就是CD4+CD25+Foxp3+Treg。但Foxp3表达在胞浆内，不论用流式细胞仪或磁珠分选均要先固定再破膜，这样会损伤所分选的细胞，研究发现CD4+CD25+CD127-等同于CD4+CD25+Foxp3+。本资料显示，子宫内膜癌患者CD4+CD25+CD127-Treg占CD4+T细胞比例显著高于健康志愿者。与其他恶性肿瘤患者外周血Treg水平升高一致。Treg数量升高，有助于子宫内膜癌细胞免疫逃逸。作者认为，子宫内膜癌的发生、发展过程中，Treg数量增加从而导致免疫耐受。但Treg水平与分期、分化、年龄等因素无明显相关性。

关于Treg在肿瘤免疫逃逸中的具体机制已开展了较多研究。目前认为，天然Treg来源于胸腺，但也可以在持续抗原刺激及IL-10、TGF-β等细胞因子条件下在外周诱导产生。Treg具有免疫无能和免疫抑制两大功能，通过与细胞直接接触发挥其免疫抑制作用，如抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖、抑制NKT细胞的增殖及分泌IL-2等细胞因子、下调DC表面共刺激分子的表达、降低抗原提呈的效率［6］。在恶性肿瘤患者中，较多由自体同源T细胞识别的肿瘤相关抗原已被证实是正常的自体成分，表明肿瘤免疫在一定程度上也是一种自身免疫。肿瘤环境中Treg比例增加，减弱机体的抗肿瘤免疫。Visser等［7］检测23例宫颈癌患者及18例宫颈上皮内瘤变患者的外周血Treg水平，发现与健康对照组比较，宫颈癌及宫颈上皮内瘤变患者的外周血Treg比例显著升高。在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤患者的外周血和肿瘤局部，Treg数目增加，且Treg数量与肿瘤的严重程度呈负相关［2～4，8］。Kono等［8］发现胃癌患者Treg数目越多，预后越差，生存率越低，在手术治疗后，患者体内的Treg数目明显减少，当肿瘤复发时，患者体内Treg数目又明显增高。研究者利用小鼠恶性黑色素瘤种植模型，去除小鼠体内的Treg细胞，发现在短期内可以抑制肿瘤的进展，一方面表明Treg细胞确实参与抑制肿瘤免疫反应，另一方面也表明恶性黑色素瘤细胞可以诱导Treg细胞的增殖。目前，Treg细胞作为肿瘤免疫治疗干预靶点的研究已经开展，但其中最大的障碍是如何在激发有效的抗肿瘤免疫反应的同时避免自身免疫性疾病的发生。随着对Treg特征和功能的研究深入，合理、有效的抑制Treg对肿瘤的免疫抑制作用，联合手术、化疗、放疗及其他免疫治疗方法，将开辟有效治疗肿瘤新途径。

本资料结果证实Treg参与子宫内膜癌免疫耐受。但肿瘤免疫是一个复杂的网络，涉及多种机制的参与，关于Treg在子宫内膜癌免疫耐受中的具体机制尚知之甚少，对其深入研究有助于进一步了解子宫内膜癌的生理、病理及免疫学机制，同时有助于帮助判断子宫内膜癌患者的病情及预后，为开发子宫内膜癌免疫治疗靶点提供新的思路。

1 Nishikawa H， Sakaguchi S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology，2014，27：1～7.

2 Lau KM， Cheng SH， Lo KW， et al. Increase in circulating Foxp3+CD4+CD25high regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients. Br J Cancer， 2007，96（4）：617～622.

3 Tan W， Zhang W， Strasner A， et al. Tumour-infiltrating regulatory T cells stimulate mammary cancer metastasis through RANKL-RANK signalling. Nature， 2011，470 （7335）：548～553.

4 Shen L-S， Wang J， Shen D-F， et al. CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells express Foxp3 and suppress effector T cell proliferation and contribute to gastric cancers progression. Clinical Immunology，2009， 131（1）：109～118.

5 Schreiber RD， Old LJ， Smyth MJ. Cancer Immunoediting： Integrating Immunity's Roles in Cancer Suppression and Promotion. Scien ce，2011，331（6024）：1565～1570.

6 Nishikawa H， Sakaguchi S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Current Opinion in Immunology.2014，27：1～7.

7 Visser J， Nijman HW， Hoogenboom BN， et al. Frequencies and role of regulatory T cells in patients with （pre）malignant cervical neoplasia. Clinical & Experimental Immunology， 2007，150（2）：199～209.

8 Kono K， Kawaida H， Takahashi A， et al. CD4（+）CD25high regulatory T cells increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunology， Immunotherapy， 2006，55（9）：1064～1071.

Objective to investigate the frequency of CD4+CD25+CD127-regulatory T cells in CD4+T cells in peripheral blood of the patients with endometrial cancer. Methods 82 patients with emdometrial cancer admitted in Zhejiang Tumor Hospital from August 2012 to August 2014 and 30 healthy women （controls） were included in this study. The frequency of CD4+CD25+CD127-regulatory T cells in CD4+T cells in peripheral blood was detected by fl ow cytometry and its relation with tumor stage and differentiation degree was analyzed. Results The frequency of CD4+CD25+CD127-regulatory T cells in CD4+T cells in peripheral blood of 82 patients with endometrial cancer was （4.89±1.42）%，signifi cantly higher than that in control group. But no signifi cant difference was found with that in tumor stage and differentiation degree. Conclusion Compared with that in healthy women，the frequency of CD4+CD25+CD127-Treg in the peripheral blood of endometrial cancer patients showed a signifi cant increase，which may be responsible for immune tolerance in endometrial cancer.

Emdometrial cancer Regulatory T cells Pperipheral blood Flow cytometry

浙江省自然科学基金（LY13H160026）

310022 浙江省肿瘤医院妇瘤科