光照强度和温度对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响*

陶云莹， 王巧晗， 赫　勇， 宫庆礼

(中国海洋大学水产学院， 山东 青岛 266003)



研究简报

光照强度和温度对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响*

陶云莹， 王巧晗**， 赫勇， 宫庆礼

(中国海洋大学水产学院， 山东 青岛 266003)

本文探讨了光照强度和温度2个生态因子对雨生红球藻(Haematococcusplivialis)生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响。研究表明，光照强度、温度及二者交互作用对雨生红球藻的生长、虾青素及内源脱落酸的积累均有显著影响(P<0.05)。温度23℃时，细胞密度随光照强度的升高呈先上升后下降趋势，在200μmol/(m2·s)时达到最大值4.9×105个/mL。适当的高光照强度和高温均能促进雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的积累，过高则起抑制作用。培养期间雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的最大峰值分别为6.266mg/L和322.641ng/g(干重)，且最大峰值均出现于27℃、200μmol/(m2·s)处理组。脱落酸含量的最大值出现在虾青素快速积累前，且在雨生红球藻的生活周期中，孢囊形成期的内源脱落酸含量最高。本研究所得到的规律对规模化培养雨生红球藻具有一定的指导意义。

光照强度； 温度； 雨生红球藻； 生长； 虾青素； 内源脱落酸

引用格式：陶云莹， 王巧晗， 赫勇， 等. 光照强度和温度对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版), 2016, 46(8): 28-36.

TAO Yun-Ying, WANG Qiao-Han, HE Yong， et al. Effects of light intensity and temperature on the growth and accumulation of astaxanthin and endogenous abscisic acid (ABA) ofHaematococcusplivialis[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(8): 28-36.

雨生红球藻(Haematococcusplivialis)是一种淡水单细胞绿藻，隶属于绿藻门(Chlorophata)团藻目(Volvocales)红球藻科(Haemetococcaccac)红球藻属(Haematococcus)[1]。该藻生活周期复杂，根据其细胞形态及细胞内色素比值的不同，大致可以分为营养型细胞生长、孢囊形成、孢囊成熟和萌发4个时期[2]。当受到环境胁迫时，雨生红球藻的细胞增殖速率降低，细胞从营养型细胞生长期向孢囊形成期转变，并伴随着虾青素的大量积累[3]，虾青素含量可高达细胞干重的2%～4%，一般为微生物中类胡萝卜素含量的10～50倍，被公认为自然界中天然虾青素含量最高的生物，是用来获取天然虾青素的理想材料[4]。

虾青素(Astaxanthin)又称“虾黄素”，是一种红色的类胡萝卜素酮化物[5]。研究表明，虾青素具有极高的经济价值，它不仅作为天然着色剂被添加到饲料中，用于鲑鱼、三文鱼等水产动物及家禽、家畜的饲养[6]，还因具有超强的抗氧化活性被应用到临床医学[7]、保健、美容护肤等行业[8]。因此，利用雨生红球藻规模化生产虾青素已成为国际藻类学研究的热点之一。

脱落酸(Abscisic acid, ABA)又被称作植物的“胁迫激素”，是一种植物体内存在的具有倍半萜结构的植物内源激素，它不仅能调控植物的生长发育，还能在干旱、高温等逆境胁迫中，作为植物的抗逆诱导因子[9]。而雨生红球藻中虾青素的快速积累也发生在胁迫环境下[10]，因此，我们猜测雨生红球藻中内源脱落酸的合成和虾青素的积累相关联。但目前尚未有人研究过雨生红球藻中虾青素积累与内源脱落酸的关系，仅孟春晓等研究添加外源脱落酸能促进雨生红球藻中虾青素的积累[11]。

本文主要研究了光照强度、温度及其交互作用对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响，旨在查明雨生红球藻内源脱落酸对环境胁迫的响应，以及内源脱落酸的产生与虾青素积累之间的关系，为雨生红球藻的大规模工厂化生产提供理论依据。

1　材料与方法

1.1 实验藻种与培养基

雨生红球藻由中国海洋大学微藻种质库提供。实验所用培养基为MCM培养基。

1.2 培养方法与实验设计

1.2.1培养方法将生长状态良好，健康活跃的雨生红球藻接种至无菌的MCM培养基，置于光生物反应器中连续充气培养至指数生长期。实验将指数生长期的藻细胞接种至装有2500mL的无菌MCM培养基的锥形瓶中培养，起始密度为1×105个/mL，置于光照培养箱中进行不同的光照强度和温度的处理，连续光照且充气培养16d。

1.2.2实验设计根据预实验及目前雨生红球藻研究的综合结果，按L9(34)正交表设计双因素3水平实验，即光照强度为50，200，350μmol/(m2·s)；温度为23，27，31℃，共9个处理，每个处理下设3个重复。从接种藻细胞起，每隔1d取样测定藻细胞密度、虾青素、类胡萝卜素及叶绿素含量，并镜检藻细胞形态变化，每隔3d取500mL藻样，离心冷冻干燥后测藻细胞干重，并称取相同质量的干藻置于-80℃下冷藏保存，用以测定藻细胞内源脱落酸的含量。

1.3 生物量

细胞密度用来表示藻细胞的生长速率，而细胞干重能准确的表示藻细胞的最终生物量，因为不同条件下单个细胞积累的虾青素含量不同，其质量也不同，所以细胞密度和细胞干重可能会出现不同的实验结果。因而实验采用细胞密度和细胞干重2种指标来衡量各处理对雨生红球藻生长的影响。

1.3.1 细胞密度实验每隔1d取样，在光学显微镜下使用血球计数板进行计数，每个样品计数4次，取平均值。

1.3.2 藻细胞干重定期从各样品中取500mL的藻液，离心去除上清液后，将沉淀的藻细胞转至已称重的玻璃器皿中(W1)，并置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，快速称量冷冻干燥后藻细胞和器皿的总质量(W2)，计算出单位体积藻的干重W(g/L)。

1.4 叶绿素a含量的测定

采用分光光度计法[12]，分别测定665和750nm处甲醇提取液的吸光度A665和A750，单位体积雨生红球藻的叶绿素a含量由下列公式计算:

C叶绿素a=13.9×(A665-A750)×U/V。

式中,C叶绿素a的单位为mg·L-1,U为甲醇体积，V为藻液体积。

1.5 虾青素含量的测定

采用分光光度计法[13]，测定490nm处二甲基亚砜(DMSO)提取液的吸光度A490，则单位体积雨生红球藻的虾青素含量用下列公式计算:

C虾青素=4.5×A490×Va/Vb。

式中，C虾青素的单位为mg·L-1，Va为提取液体积，Vb为藻液体积。

1.6 类胡萝卜素含量的测定

采用分光光度计法[14],分别测定480、645和663nm处丙酮提取液的吸光度A480、A645和A663，则单位体积雨生红球藻的类胡萝卜素含量用下列公式计算:

C类胡萝卜素=(A480+0.144×A663-0.638×A645)×4.6×稀释倍数。

1.7 内源脱落酸含量的测定

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定内源脱落酸的含量[15]，试剂盒从中国农业大学购得，按照操作指南进行测定。为了准确表示雨生红球藻中内源脱落酸的含量，实验用冷冻干燥法去除水分后，称取相同质量的藻粉,用来测定内源脱落酸含量，单位用ng/g(干重)表示。

1.8 数据处理

数据以平均值±标准差表示。用统计软件SPSS17.0对所得的数据进行双因子方差分析(P<0.05表示差异显著)，结果差异显著则进行多重比较(Duncan)。用绘图软件Sigmaplot10.0作图。

2　结果与分析

2.1 光照强度和温度对雨生红球藻生长的影响

光照强度和温度对雨生红球藻细胞密度的影响见表1。光照强度和温度对雨生红球藻生长均有极显著影响(FL=560.43，FT=300.56；P<0.01)，二者的交互作用极显著(F=125.62，P<0.01)。其中光照强度对雨生红球藻生长的影响大于温度的影响。细胞计数结果表明，雨生红球藻在不同的光照强度和温度处理下，细胞的生长速度明显不同，且随时间的推移，各处理组的细胞密度均呈先上升后下降趋势。由表1可知，雨生红球藻培养期间，温度为23℃时，随光照强度的增加，细胞密度先上升后下降，且在培养的第12天光照强度为200μmol/(m2·s)时，细胞密度最高，最大值为4.9×105个/mL。然而，当温度为27和31℃时，其细胞密度随光照强度的上升而下降，且在31℃ 350μmol/(m2·s)处理下，出现细胞密度的最小值1.1×105个/mL。

光照强度和温度对雨生红球藻细胞干重的影响见图1。不同光照强度和温度处理下，雨生红球藻的最终藻干重差异显著。如图1所示，光照强度为50μmol/(m2·s)时，温度对雨生红球藻细胞干重的影响差异不显著(这与细胞密度的实验结果不同，因为培养后期虾青素的积累会对雨生红球藻最终生物量会产生影响)，而在200和350μmol/(m2·s)的光照处理中，随着温度的升高，雨生红球藻的细胞干重下降明显。且在23℃ 200μmol/(m2·s)处理下的细胞干重最大，为0.298g/L，在31℃ 350μmol/(m2·s)处理下的细胞干重最小，为0.104g/L。

表1　光照强度和温度对雨生红球藻细胞密度的影响

注：同一列中不同的字母(a,b,c)表示经过多重检验(Duncan)相互之间的差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions.

(不同字母表示处理间的差异显著。Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions. Vertical bars indicate±SD(n=3).)

图1光照强度和温度对雨生红球藻细胞干重的影响

Fig.1Effects of different light intensity and temperature on the dry weight ofH.plivialis

2.2 光照强度和温度对雨生红球藻中虾青素积累的影响

双因子方差分析表明，光照强度和温度对雨生红球藻虾青素的积累影响极显著(FL=4099.33，FT=7970.98；P<0.01)，二者对虾青素积累的交互作用也极为显著(F=10048.23，P<0.01)，其中温度的影响大于光照强度的影响。不同光照强度和温度条件下雨生红球藻中虾青素的积累见表2。实验结果表明，各处理下雨生红球藻中虾青素的含量，随着时间的推移均不断升高，但不同处理下虾青素积累的速率明显不同。如表2所示，雨生红球藻在200和350μmol/(m2·s)的高光照强度诱导下，从第10天开始快速积累虾青素，而在低光照强度50μmol/(m2·s)诱导下，培养14d后虾青素才开始快速积累，且含量较低。此外，温度为23℃时，雨生红球藻中虾青素的含量随着光照强度的升高而升高，而温度为27和31℃时，雨生红球藻中虾青素的含量随着温度的升高呈先上升后下降的趋势。实验中虾青素含量的最大值出现在27℃ 200μmol/(m2·s)条件下，为6.266mg/L，而虾青素含量的最小值出现在31℃ 350μmol/(m2·s)条件下，为3.280mg/L。

本实验还研究了不同光照强度和温度组合下雨生红球藻中类胡萝卜素/叶绿素的比值的变化情况，如表3所示。各个处理下的雨生红球藻中类胡萝卜素/叶绿素的比值均随时间的推移而增大，在31℃ 350μmol/(m2·s)处理下出现最大值，为5.684。此外，类胡萝卜素/叶绿素的比值表现出和虾青素积累相似的变化趋势，即在光照强度为50μmol/(m2·s)的虾青素积累较慢的3个处理组中，类胡萝卜素/叶绿素的比值也增加缓慢。

2.3光照强度和温度对雨生红球藻中内源脱落酸(ABA)含量的影响

双因子方差分析表明，光照强度和温度对雨生红球藻内源脱落酸的积累影响极显著(FL=1127.82，FT=2272.57；P<0.01)，二者对内源脱落酸的交互作用也极为显著(F=2758.94，P<0.01)，其中,温度影响要大于光照强度的影响。不同光照强度和温度条件下雨生红球藻中内源脱落酸的积累见表4。结果表明，各个处理组中雨生红球藻内源脱落酸的含量均呈先上升后下降的变化趋势，即都有一个峰值，但峰值出现的时间不同。如表4所示，雨生红球藻在200和350μmol/(m2·s)的高光照强度诱导下，内源脱落酸含量在第8天出现峰值；在50μmol/(m2·s)低光照强度诱导下，内源脱落酸在第12天才达到最大值，且相对含量较低。最大峰值出现在27℃ 200μmol/(m2·s)处理组，内源脱落酸含量为322.641ng/g，最小峰值出现在31℃ 350μmol/(m2·s)处理组，内源脱落酸含量为138.333ng/g。

表4　光照强度和温度对雨生红球藻内源脱落酸积累的影响

注：同一列中不同的字母(a,b,c)表示经过多重检验(Duncan)相互之间的差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions.

如图2所示，各个处理下雨生红球藻中内源脱落酸的含量均在孢囊形成期最高，孢囊成熟期其次，营养型细胞生长期最低。并且在23℃时，内源脱落酸的含量随着光照强度的升高而升高；在27℃时，其含量随着光照强度的升高呈先上升后下降的趋势；在31℃时，内源脱落酸的含量随着光照强度的升高而下降。

(图中横坐标上的字母是指雨生红球藻生活周期的3个阶段，VC表示营养型细胞生长期，EC表示孢囊形成期，MC表示孢囊成熟期。图中不同字母表示处理间的差异显著。The letter of VC、EC、MC respectively mean vegetative cell, immature cyst and mature cyst, which are the different stages in life cycle ofH.plivialis.VC means vegetative cell growth, EC means encystment, MC means maturation. Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions. Vertical bars indicate ±SD(n=3).)

图2光照强度和温度对雨生红球藻中内源脱落酸含量的影响

Fig.2Effects of different light intensity and temperature on the endogenous ABA content ofH.plivialis

3　讨论

3.1 光照强度和温度对雨生红球藻生长的影响

光照强度和温度是影响植物生长繁殖的重要环境因子[16]。首先本实验在不同温度条件下，光照强度对雨生红球藻生长的影响差异显著。由表1可知，23℃ 处理组中，光照强度为200μmol/(m2·s)时雨生红球藻细胞密度最大，表明适宜的温度下，适当提高光照强度能促进雨生红球藻细胞密度的增加，但光照强度过强时，细胞密度将受到抑制。这是由于植物都有一个光合补偿点和光合饱和点，在这两点之间光照强度增加，光合作用加快，反之超过了光合饱和点，就会减弱甚至抑制光合作用。而当温度水平较高(27和31℃)时，雨生红球藻的细胞密度都在50μmol/(m2·s)的光照条件下最大，随光照强度的上升而受到抑制。这可能是由于光照强度和温度的协同作用所致。如温度升高增加了高光照强度下微藻对光能的热耗散，从而降低了通过光合电子传递链传递用于碳同化的光能，表现出微藻生长受抑制[17]。其次，由图1可知，高温不利于雨生红球藻的生长繁殖，这与蒋霞敏等所得的温度超过30℃将不利于雨生红球藻生长的研究结果一致[18]。就光合作用而言，高温能降低卡尔文循环的活性，从而阻碍同化产物代谢[19]，且温度较高时雨生红球藻的光合放氧速率降下[20]的结论也可以用来解释这一现象。实验还表明，高温高光的交互作用对雨生红球藻的细胞密度有显著的影响，能明显抑制其生长。尤其是31℃ 350μmol/(m2·s)处理组中的雨生红球藻，培养期间镜检发现，出现细胞自溶死亡的现象较多，该过程中细胞内部色素逐渐消失，内含物释放分解，最后残存透明的外壳[21]。

实验结果中发现23℃ 200μmol/(m2·s)的温光条件最适宜雨生红球藻的生长繁殖，细胞密度最大值为4.9×105个/mL。其中最适生长的温度条件与欧阳琴[22]等报道的24℃相近，表明较低的温度更有利于雨生红球藻的生长。实验中发现不同温度下，雨生红球藻最适生长的光照强度不同，温度较低的处理组，最适光照强度为200μmol/(m2·s)，而温度较高的处理组，最适光照强度为50μmol/(m2·s)，出现这一结果的原因可能是温度和光照强度的交互作用所致。已有研究也表明，不同研究结果得出的雨生红球藻的最适宜光照强度不同，You等认为80～120μmol/(m2·s)为生长的最适光照强度[23]，而Christoph等则认为低于30μmol/(m2·s)时有利于藻细胞的生长[24]。这也可能是由于实验藻种的品系不同而造成的。

3.2 光照强度和温度对雨生红球藻虾青素积累的影响

光照强度和温度对植物次生代谢产物的积累有很大影响[16]。本实验不同温度条件下，光照强度对雨生红球藻中虾青素积累的影响差异显著。由表2可知，23℃处理组中，光照强度为350μmol/(m2·s)时雨生红球藻中虾青素的含量最高；27℃处理组中，200μmol/(m2·s)光照条件下雨生红球藻中虾青素的含量最高。这表明适当增大光照强度有利于雨生红球藻中虾青素的积累，但过高的光照强度则会抑制其合成。这与Harker等的结论一致，他们认为高光能促进虾青素的快速积累，但是强度过高可能会导致雨生红球藻的大量死亡[25]。就光保护学说而言，藻细胞中虾青素的产生能保护光合色素免受强光的伤害，从而抵御外界胁迫，但当胁迫程度超出其防御范围细胞就会受到损伤，从而降低虾青素的产量。这还说明光照强度和温度的交互作用对雨生红球藻中虾青素积累影响显著。因为温度越高，藻细胞对光照强度的敏感性越高，如350μmol/(m2·s)的光照强度，能促进23℃下雨生红球藻中虾青素的合成，却对27℃下藻细胞中虾青素的积累起抑制作用。本实验藻细胞在27℃ 200μmol/(m2·s)条件下，虾青素的产量最高，为6.266mg/L。张丽根据四因素三水平正交试验，得到2种品系适宜虾青素积累的条件组合均为：光照200μmol/(m2·s)，NaNO30mg/L，NaCl 2g/L，温度27℃[26]，与本实验结果相契合。我们还发现适当的提高温度能促进虾青素的合成，但温度过高也不利于雨生红球藻中虾青素的积累。这可能是由于过高的温度会降低虾青素合成途径中关键酶(PSY和CRTR-B)的活性[27]，从而抑制类虾青素的合成。如实验中31℃下雨生红球藻虾青素的含量普遍较低。

Makio Kobayasi等人在研究雨生红球藻生活周期中时，发现类胡萝卜素/叶绿素的比值随着虾青素的积累而不断增大，并可以作为区别雨生红球藻生活史阶段的有效参数[2]。他们还指出雨生红球藻在营养型细胞生长、孢囊形成和孢囊成熟期的类胡萝卜素/叶绿素的比值分别为0.5、1.0和7.0[28]。本实验中因培养天数较短，类胡萝卜素/叶绿素的比值尚未达到7.0，故以3.0的比值来标志孢囊成熟期的开始。已报道虾青素和叶绿素的吸光值分别与其含量呈线性关系，高政权等曾用类胡萝卜素/叶绿素的比值衡量水杨酸诱导过程中雨生红球藻细胞虾青素含量的变化趋势[29]。本实验雨生红球藻中类胡萝卜素/叶绿素的比值与虾青素积累有着相似的变化趋势。从生理学角度讲，细胞的生理特性与色素的积累有着很强的相关性[30]。随着培养时间的推移，培养基中氮元素不断下降，而氮是叶绿素的组成元素，因而藻细胞中叶绿素的含量会有所下降。而胁迫条件下，藻细胞中光合速率下降及呼吸作用增强导致细胞内氧自由基的大量积累，会诱导虾青素的合成及其他生理反应[31-32]，从而导致类胡萝卜素/叶绿素的比值不断上升。

3.3光照强度和温度对雨生红球藻内源脱落酸的影响

研究表明光照强度、温度及二者的交互作用对雨生红球藻中内源脱落酸的积累均有显著影响。首先不同温度下，光照强度对雨生红球藻中内源脱落酸的积累影响显著。如图2所示，在23℃处理组中，光照强度为350μmol/(m2·s)时藻细胞中内源脱落酸的含量最高。表明高光照强度能诱导“胁迫激素”内源脱落酸的合成。这可能与内源脱落酸能应对胁迫环境的作用有关[9]。其次，本实验在较高的温度(27和31℃)处理组中，光照强度过高将减少藻细胞中内源脱落酸的合成。实验中内源脱落酸含量的最大值出现在27℃ 200μmol/(m2·s)，为322.641ng/g，最小值出现在31℃ 350μmol/(m2·s)，为138.333ng/g。表明光照强度和温度的交互作用对藻细胞中内源脱落酸的合成影响显著。另外，实验发现不同光照条件下，温度对雨生红球藻的内源脱落酸含量的影响差异显著。50μmol/(m2·s)处理组中，温度为31℃时，雨生红球藻的内源脱落酸含量最高，表明高温能促进雨生红球藻中内源脱落酸的合成。这与高夕全等的研究结果一致，他们的研究表明，低温胁迫和高温胁迫都能导致稻胚中内源脱落酸水平的升高[33]。孙雪研究也表明高温胁迫下，海洋红藻龙须菜能通过升高内源ABA含量，做出应激反应来减少逆境对藻体的伤害[34]。

由表4可知，在雨生红球藻培养过程中，内源脱落酸的含量都有一个峰值，但峰值出现的时间不同，低光照组(50μmol/(m2·s))在实验的第12天出现峰值，而其它处理组(200和350μmol/(m2·s))则在第8天出现峰值。这些差异可能是由不同光温处理下雨生红球藻进入同一生活周期阶段所需的时间不同引起的。图2所示，雨生红球藻不同生活周期中内源脱落酸的含量不同，且在虾青素快速积累前的孢囊形成期含量最高，这与Janat Sarmad等报道的杜氏盐藻中脱落酸的合成比β-胡萝卜素的积累早的结果一致。他们猜测这可能是由于脱落酸参与到β-胡萝卜素的合成导致[35]。因此我们认为，雨生红球藻中脱落酸的大量合成对虾青素的快速积累而言可能是必不可少的前提或是一种必然因素。众所周知，虾青素是β-胡萝卜素的衍生物，已有研究证实，虾青素合成关键酶β-胡萝卜素酮化酶(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶(crtR-B)基因的5’端上游侧翼序列中存在脱落酸反应元件(ABRE)[36-37]。此外，雨生红球藻中虾青素的积累常伴随着藻细胞体积增大[21]，而Jia等在研究水分胁迫下脱落酸启动与调节的结果表明，ABA积累的触发与细胞体积的改变有关[38]。因此，作者认为虾青素积累和内源脱落酸合成之间存在一定的必然联系，但具体的调控机理还需进一步的实验研究。

4　结语

本实验研究表明光照强度、温度和二者的交互作用对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响显著，且内源脱落酸的含量的增加总是出现在虾青素的快速积累的前期，表明内源脱落酸水平的升高可能是虾青素快速合成的诱导因子。利用该结论可能会加速实现雨生红球藻中天然虾青素的规模化生产，这对促进中国虾青素产业的发展具有重要意义。

[1]王铭, 李涛, 李爱芬, 等. 光照、温度和pH对雨生红球藻光合性的影响[J]. 水生生物学报, 2009, 33(3): 400-405. Wang Ming, Li Tao, Li Ai-fen, et al. Effects of light intensity, temperature and pH on photosynthetic characters ofHaematococcuspluvialis[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(3): 400-405.

[2]Makio K, Yoshiro K, Toshihide K, et al. Morphological changes in the life cycle of the green algaHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1997, 84(1): 94-97.

[3]梁英, 陈书秀. 温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响[J]. 海洋湖沼通报, 2009, 3: 112-120.

Liang Ying, Chen Shu-Xiu. Effects of different temperatures on the chlorophyll fluorescence parameters and astax anthin content ofHaematococcuspluvialis[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2009, 3: 112-120.

[4]魏东, 藏晓南. 大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状[J]. 中国海洋药物, 2001, 5: 4-8.

Wei Dong, Zang Xiao-nan. Production of natural astaxanthin by mass cultivation ofHaematococcuspluvialis: research advances and current situation of industrialization [J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2001, 5: 4-8.

[5]Lorenz R T， Cysewski G R. Commercial potential forHaematococcusmicroalgae as a natural source of astaxanthin[J]. Trends in Biotechnology, 2000, 18(4): 160-167.

[6]Nelis H J, De Leenheer A P. Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds [J]. Journal of Applied Bacteriology, 1991, 70(3): 181-191.

[7]Chew B P, Park J S. Carotenoid action on the immune response[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(1): 257-261.

[8]Guerin M, Huntley M E, Olaizola M.Heamatococcusantaxanthin: applications for human health and nutrition[J]. Trends in Biotechnology, 2003, 21(5): 210-216.

[9]郝格格, 孙忠福, 张录强, 等. 脱落酸在植物逆境胁迫研究中的进展[J]. 中国农学通报, 2009, 25(18): 212-215.

Hao Gege, Sun Zhong-fu, Zhang Lu-qiang, et al. A research overview of the plant resistance to adverse environment by using abscisic acid[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(18): 212-215.

[10]庄惠如, 卢海声, 陈必链, 等. 雨生红球藻营养细胞的虾青素累积[J]. 水生生物学报, 2001, 25(4): 376-380.

Zhuang Hui-ru, Lu Hai-sheng, Chen Bi-lian, et al. Astaxanthin accumulation in vegetative cell ofHaematococcuspluvialis[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2001, 25(4): 376-380.

[11]孟春晓, 高政权. 外源脱落酸(ABA)对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].黑龙江畜牧兽医, 2007, 7: 68-69.

Meng Chun-xiao, Gao Zheng-quan. Effects of exogenous abscisic acid on the astaxanthin accumulation ofHaematococcuspluvialis[J]. Hei Long Jiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2007, 7: 68-69.

[12]Azov Y . Effect of pH on inorganic Carbon Uptake in Algal Cultures[J]. Journal of Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43(6): 1300-1306.

[13]Boussiba S, Vonshak A. Aastaxanthin accumulation in the green algaHaematococcuspluvialis[J]. Plant Cell Physiological， 1991(32): 1077-1082.

[14]Goodwin T W, Davies B H. Chemistry and Biochemistry of Plant pigments[M]. America: Academic Press, 1976, 2: 149-155.

[15]陈顺钦, 黄璐琦, 袁媛, 等. 光照对黄芩悬浮细胞内源激素与有效成分相关性的影响[J]. 中国实验方剂学杂志， 2010, 4: 72-74.

Chen Shun-qin, Huang Lu-qi, Yuan Yuan, et al. Effects of light on the endogenous hormones and the relevance with active ingredient of scutellaria suspensiond[J]. Chinese Joural of Experimental Traditional Medical Formulae, 2010, 4: 72-74.

[16]任长江. 光强对雨生红球藻生长的影响[J]. 河南师范大学学报(自然科学版), 2008, 6: 111-113.

Ren Chang-jiang. Effect of various light intensity on the growth ofHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Henan Normal University ( Natural Science) , 2008, 6: 111-113.

[17]张曼, 曾波, 王明书, 等. 温度升高对高光强环境下蛋白核小球藻光能利用和生长的阻抑效应[J]. 生态学报, 2007, 27(2): 662-667.

Zhang Man, Zeng Bo, Wang Ming-shu, et al. The temperature elevation suppresses the light enery utilization and growth ofChlolorellapyrenoidosaunder high light intensity conditions[J]. Acta Ecologica Singica, 2007, 27(2): 662-667.

[18]蒋霞敏, 柳敏海, 沈芝叶, 等. 温度、光照与盐度对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控[J]. 中国水产科学, 2005, 6: 714-719.

Jiang Min-xia, Liu Min-hai, Shen Zhi-ye, et al. Effects of temperature , illumination and salinity on astaxanthin accumulation inHaematococcuspluvialisaberrant species[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2005, 6: 714-719.

[19]Jiao J, Grodzinski B. The effect of leaf temperature and photo respiratory conditions on export of sugars during steady-state photo synthesis inSalviassplendons[J]. Plant Physiology, 1996, 111: 169-178.

[20]张宝玉, 李夜光, 李中奎, 等. 温度、光照强度和pH对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响[J]. 海洋与湖沼, 2003, 5: 558-565.

Zhang Bao-yu, Li Ye-guang, Li Zhong-kui, et al. Effects of temperature, light intensity and pH on photosynthesis and growth rate ofHaematococcuspluvialis[J]. Oceanology and Limnology, 2003, 5: 558-565.

[21]刘建国, 殷明炎, 张京浦, 等. 雨生红球藻的细胞周期初探[J]. 海洋与湖沼, 2000, 2: 145-150.

Liu Jian-guo, Yin Ming-yan, Zhang Jing-pu, et al. Studies of cell cycle inHaematococcuspluvialis[J]. Oceanology and Limnology, 2000, 2: 145-150.

[22]欧阳琴. 雨生红球藻的培养及虾青素的提取[D]. 福州: 福州大学, 2004.

Ou Yang-qin. The Study ofHaematococcusPluvialisCulture Conditions and Astaxanthin Extraction and Purification[D]. Fuzhou： Fuzhou University, 2004.

[23]You C J, Chul W C, Yeoung S Y. Combined effects of light intensity and acetate concentration on the growth of unicellular microalga Haematococcus pluvialis[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 490-495.

[24]Christoph H, Kay G, Marco X, et al. Effect of cultivation parameters on growth and pigment biosynthesis in flagellated cells of Haematococcus pluvialis. [J]. Applied Phycology, 2001, 13: 79-87.

[25]Harker M, Tsavalos A J. Factor responsible for astaxanthin formation in the ChlorphyteHaematococcuspluvialis[J]. Bioresource Technology, 1996, 55(3): 207-214.

[26]张丽. 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化[D]. 青岛: 青岛科技大学, 2010.

Zhang Li. UV Mutagenesis, Ammonium-Tolerant Strain Selection and Culture Condition Optimization ofHaematococcusPluvialis[D]. Qingdao: Qingdao University of Science and Technology, 2010.

[27]邱保胜, 刘其芳. 雨生红球藻培养条件研究[J]. 华中师范大学学报, 1999, 1: 112-118.

Qiu Bao-sheng, Liu Qi-fang. Studies about culture conditions ofHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Hua Zhong Normal University, 1999, 1: 112-118.

[28]M Kobayashi, Y Todoroki, N Hirai, et al. Biological activities of abiscisic acid analogs in the Morphological change of the Green AlgaHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, 85(5): 529-531.

[29]高政权, 孟春晓, 刁英英. 施用水杨酸对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J]. 水产科学, 2007, 26(7): 377-380.

Gao Zheng-quan, Meng Chun-xiao, Diao Ying-ying. The effect of extraneous salicy acid on astaxanthin in accumulation of algaHaematococcuspluvialis[J]. Fisheries Science , 2007, 26(7): 377-380.

[30]王群, 桑敏, 李爱芬. 雨生红球藻培养过程中色素动态变化与光和生理特性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2010, 22(5): 850-854.

Wang Qun, Sang Min, Li Ai-fen. The dynamic change of pigments and photosynthetic physiological characteristics ofHaematococcuspluvialiscultures[J]. Natural Product Research and Development, 2010, 22(5): 850-854.

[31]Hagen G, Braune W. Function aspects of second-way carotenoids inH.pluvialis[J]. Phycology, 1994, 30: 241-248.

[32]秦山, 刘国祥, 胡郑宇. 斜生栅藻中虾青素的积累过程及其光和活性变化[J]. 水生生物学报, 2009, 33(3): 509-515.

Qin Shan, Liu Guo-xiang, Hu Zheng-yu. The accumulation of astaxanthin and the response of photosynthetic activity inscenedesmusobliquus[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(3): 509-515.

[33]高夕全, 夏凯, 周燮. 温度胁迫对稻胚酯酶同工酶、蛋白质和内源脱落酸(ABA)水平的影响[J]. 安徽农业技术师范学院学报, 1999, 13(4): 12-16.

Gao Xi-quan, Xia Kai, Zhou Yan. Effects of low and high temperature stress on esterase lsoenzyme and protein and endogenous ABA content in young embryo of rice[J]. Anhui Agricultural Technical Teachers College, 1999, 13(4): 12-16.

[34]孙雪, 蔡西栗, 徐年军. 海洋红藻龙须菜对2种逆境温度胁迫的应激生理响应[J]. 水生生物学报, 2013, 37(3): 535-540.

Sun Xue, Cai Xi-li, Xu Nian-jun. Physiological response of marine red algae gracilaria lemaneiformis to two kinds of adverse temperature stress[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(3): 535-540.

[35]Sarmad J, Shariati M, Haghjou M M, et al. Relationship between endogenous abscisic acid and β-carotene synthesis in unicellular green algaDunaliella[J]. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Scientific, 2007, 2(5): 559-564.

[36]Chunxiao Meng, Changying Teng, Peng Jiang, et al. Cloning and characterization of β-carotene ketolase gene promoter inHaematococcuspluvialis[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(4): 215-282.

[37]Meng C X, Wei W, Su Z, et al. Characterization of carotenoid hydroxylase gene promoter inHaematococcuspluvialis[J]. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 2006, 43(5): 284-288.

[38]Jia W S , Zhang J H , Liang J S . Initiation and regulation of water deficit-induced abscisic acid accumulation in maize leaves and roots: Cellular volume and water relations. [J]. Journal of Experimental Botany, 2001, 52(355): 295-300.

责任编辑朱宝象

Effects of Light Intensity and Temperature on the Growth and Accumulation of Astaxanthin and Endogenous Abscisic Acid (ABA) ofHaematococcusplivialis

TAO Yun-Ying, WANG Qiao-Han, HE Yong, GONG Qing-Li

(College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The effects of light intensity and temperature onHaematococcusplivialisgrowth and accumulation astaxanthin and endogenous ABA were determined in this study aimed to a identify the endogenous ABA ofH.plivialisresponding to environmental stress, determine the relationship between the generation of endogenous ABA and astaxanthin accumulation, thus providing a theoretical basis to the large-scale production ofH.plivialis. We picked out the alga at exponential growth phase, inoculated it into 2 500 mL of sterile MCM medium(initial density 1×105cells/mL), cultured the alga under different continuous light intensities and temperatures for 16days with aeration. According to the results of preliminary experiments and the present comprehensive study, we designed a two-factor cross experiment, each experimental factor is divided into three levels, and each processing group is set up three repetitions. The contents of chlorophyll, astaxanthin and carotenoid were determined by spectrophotometry, and the content of endogenous ABA was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the light intensity, temperature and their interaction had significant effects on algal growth and accumulation of astaxanthin and endogenous ABA (P<0.05). At 23 ℃, the cell density showed a downward trend after the first rise with the intensity of illumination increased. When light intensity is 200μmol/(m2·s), the cell density is the largest, and the maximum value is 4.9×105cells/mL. In addition, making an appropriate increase in light intensity or temperature can promote the accumulation of astaxanthin and endogenous ABA, however, the excessive intensity can inhibit them. Experiments explained that the maximum contents of astaxanthin and endogenous ABA were observed at 27 ℃ and 200μmol/(m2·s), which were 6.266 mg/L and 322.64 ng/g(dw), respectively. The results also showed that during the life cycle ofH.plivialis, the highest content of ABA was in immature cysts which appeared earlier than the accumulation of astaxanthin. This observation provided some evidences supporting the utilization of exogenous ABA to promote the accumulation of astaxanthin ofH.plivialis.

light intensity; temperature;Haematococcusplivialis; growth; astaxanthin; endogenous abscisic acid

2014青岛世界园艺博览会植物馆海洋展陈项目资助

2015-03-18；

2015-12-10

陶云莹(1989-)，女，硕士生。E-mail：taoyunying@yeah.net

**通讯作者：E-mail：wangqiaohan@ouc.edu.cn

S917.3

A

1672-5174(2016)08-028-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20150077

Supported by 2014 Qingdao International Horticultural Exposition Showcasing Ocean Plant Museum