基于温控载体表达胆固醇氧化酶

袁晔，张玲，邵蔚蓝，王武，杨海麟*（.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡4；.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江000）

基于温控载体表达胆固醇氧化酶

袁晔1，张玲1，邵蔚蓝2，王武1，杨海麟*1
（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212000）

胆固醇氧化酶在医药检测、食品加工、农业生产等方面都有重要的应用价值。以来源于Rhodococcus sp.的胆固醇氧化酶基因为研究对象，构建于温控表达载体pHsh上，免去了诱导剂的使用，采用温度调控使胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中成功表达。在摇瓶水平对酶的表达量进行优化，最终的酶量为855 U/L。使用镍柱将酶纯化，得到单一条带，相对分子质量约为55 kDa。分析其酶学性质，最适pH 7.0，在pH 5.0～7.0稳定；最适反应温度40℃，在50℃保温，其半衰期为6.9 min。以胆固醇为底物，在pH 7.5、37℃条件下测酶活，计算得动力学参数Km为3.38 mmol/L，kcat/Km为6.09 s-1·（mmol/L）。

胆固醇氧化酶；pHsh热激表达载体；温度诱导

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点［1］。一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。常见的表达体系有Lac/Tac表达体系［2］，PL/PR表达体系［3］和T7表达体系［4-5］，Lac/Tac表达体系需要添加诱导剂IPTG，但由于IPTG本身具有一定的毒性，常用乳糖代替；PL/ PR表达体系是利用温控启动的，热刺激过程中，大肠杆菌热休克，蛋白质表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白质，且大体积发酵培养菌体时，温度升高需要较长的时间，对重组蛋白质的表达量有一定的影响。……