临床分离耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型别多样性分析

杨永长，陈　亮，肖代雯，喻　华，刘　华，黄文芳

(四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610072)



临床分离耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型别多样性分析

杨永长，陈亮，肖代雯，喻华，刘华，黄文芳△

(四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610072)

目的探讨临床分离耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)SCCmec型别。方法收集临床分离并经全自动微生物鉴定系统准确鉴定的表皮葡萄球菌84株，通过PCR扩增esp和mecA基因准确鉴定MRSE，采用多重PCR对MRSE SCCmec进行分型，分析其分布特点。结果PCR扩增结果显示，84株临床分离表皮葡萄球菌均可扩增出esp基因，mecA检出率为76.19%(64/84)，其中血液、痰液、尿液和伤口分泌物MRSE检出率分别为76.8%、68.8%、100.0%和71.4%。多重PCR扩增结果显示，64株MRSE中，SCCmec单一型别为22株，其中SCCmecⅠ型19株、SCCmec Ⅲ型3株；SCCmec混合型为42株，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株，Ⅰ、Ⅲ混合型14株，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株，Ⅱ、Ⅲ混合型5株，Ⅲ、Ⅳ混合型9株。结论临床分离的MRSE SCCmec型别存在明显的多样性，以混合SCCmec型别为主。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；SCCmec型别；MRSE；多样性

近年来，随着抗菌药物的广泛使用，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的检出率越来越高，已成为全世界医院感染的重要病原菌[1]。我国一项细菌耐药监测结果显示，82.9%的临床分离表皮葡萄球菌对甲氧西林耐药[2]。携带mecA基因是甲氧西林耐药的主要机制，该基因位于新型的可移动元件SCCmec基因盒上，目前已发现多种SCCmec基因型，其中SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型为医院获得性，SCCmecⅣ、Ⅴ型为社区获得性。研究发现，凝固酶阴性的甲氧西林耐药葡萄球菌中SCCmec型别具有明显的多样性[3-5]，可能同时含有1～3种SCCmec型别，以及其他新的SCCmec类型[6-8]。本文通过多重PCR检测临床分离MRSE的SCCmec型别，进一步分析SCCmec型别的特点，为深入探讨MRSE的分子特征奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌株来源84株表皮葡萄球菌为2012年3月至2013年3月本院门诊及住院患者分离的无重复菌株，所有菌株采用全自动微生物鉴定系统鉴定，其中血液分离56株，痰液分离16株，中段尿液分离5株，伤口分泌物分离7株。

1.2仪器与试剂PCR 反应试剂、100 bp DNA Ladder 购自北京康为世纪，PCR 扩增仪购自美国Bio-Rad公司，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，电泳仪购自美国Savant公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司。esp、mecA和SCCmec分型的引物由上海英俊公司合成。

1.3检测方法

1.3.1细菌收集与DNA提取复苏低温保存的表皮葡萄球菌，接种至血平板，37 ℃ 5% CO2培养24 h，收集细菌，按文献[9]提取表皮葡萄球菌DNA。

1.3.2PCR扩增esp基因按照文献[10]的方法扩增esp基因，根据凝胶电泳结果判断临床分离菌株是否为表皮葡萄球菌。

1.3.3PCR扩增mecA基因按照文献[10]的方法扩增mecA基因，依据凝胶电泳结果区分MRSE和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)。

1.3.4多重PCR对MRSE SCCmec分型按照文献[11]合成引物，采用多重PCR扩增MRSE菌株SCCmec基因盒上8个位点确定其型别。

1.4统计学处理采用Excel2007软件进行数据处理及统计学分析。

2　结　　果

2.1PCR扩增esp基因鉴定表皮葡萄球菌PCR扩增结果显示，所有临床分离菌株均可扩增出244 bp的esp基因片段，表明这些菌株都是表皮葡萄球菌。

2.2PCR扩增mecA基因区分MSSE和MRSE临床分离的84株表皮葡萄球菌中，mecA扩增阳性64株(76.19%)，mecA阴性20株，其中血液、痰液、尿液和伤口分泌物MRSE检出率分别为76.8%、68.8%、100.0%和71.4%，提示不同来源分离的表皮葡萄球菌均以MRSE为主。

2.3临床分离MRSE SCCmec分型结果多重PCR扩增结果显示，64株MRSE中，SCCmec单一型别为22株(34.38%)，其中 SCCmecⅠ型19株(29.69%)，SCCmec Ⅲ型3株(4.69%)。SCCmec混合型为42株(65.62%)，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株(3.13%)，Ⅰ、Ⅲ混合型14株(21.88%)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株(18.75%)，Ⅱ、Ⅲ混合型5株(7.81%)，Ⅲ、Ⅳ混合型9株(14.06%)。部分菌株的多重PCR凝胶电泳结果见图1。

注：泳道1～7为临床分离MRSE SCCmec；M为100 bp DNA Ladder。

3　讨　　论

SCCmec是葡萄球菌属所特有的一种遗传结构，至今未发现在其他菌种含有该元件，它主要由mec基因复合体、盒式染色体重组酶基因(ccr)和无功能J区组成，根据mec和ccr可将SCCmec分为SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。目前，MRSA的SCCmec分型研究比较成熟，而耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)中SCCmec的研究则相对较少，且所携带的SCCmec也相对比较复杂，研究中不断发现新的型别和亚型。因此，研究SCCmec型别对了解MRCNS的分子特征具有重要意义。

由于地域和抗菌药物使用习惯的不同，各国流行的MRCNS菌株存在一定的差异，美国主要以SCCmecⅣ型MRSE为主[12]，而巴西医源性MRCNS主要携带SCCmecⅠ、Ⅲ型[13]。芬兰一家医疗单位分离出的61 例MRCNS中，49 例(80%)为MRSE，SCCmec类型分布具有多样性：20例(33%)Ⅳ型,11例(18%)Ⅴ型,4例(6%)Ⅰ型,3例(4%)Ⅱ型,还有23例(38%)是新类型[14]。国内有关MRCNS研究显示SCCmec型别也具有明显的多样性[5]。本研究应用Oliveira法对64株MRSE的SCCmec分型显示，SCCmecⅠ型占29.69%，SCCmec Ⅲ型占4.69%，SCCmec混合型占65.62%(包括3.13%的Ⅰ、Ⅱ混合型，21.88%的Ⅰ、Ⅲ混合型，18.75%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型，7.81%的Ⅱ、Ⅲ混合型，14.06%的Ⅲ、Ⅳ混合型)，大量混合型SCCmec菌株的出现反映了MRSE中SCCmec型别的多样性。

目前世界各地不断有新的SCCmec基因型被报道。爱尔兰学者发现在MRSA中存在SCCmecⅠ-pls型(不含pls)、SCCmecⅢ-pI258/Tn554型(不含pI258/Tn554)和SCCmec Ⅳ-dcs型(无dcs区)等变异体[15]。我国学者在海南省分离的MRSA中检测出包括缺少dcs区的Ⅰ型、缺少dcs区但包含mecⅠ区的Ⅰ型等7种SCCmec新型别[16]。本文研究结果显示MRSE中混合型SCCmec占绝大多数，笔者推测可能是由于SCCmec基因变异率高，自身不断地发生突变、插入、缺失或重组，使某些菌株不能用现有方法进行分型。

本研究利用多重PCR发现，临床分离的MRSE SCCmec具有明显的多样性，主要以混合型SCCmec为主，为进一步了解MRSE的分子特征奠定了基础。

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Diversity of SCCmec type diversity in clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis

YANGYongchang,CHENLiang,XIAODaiwen,YUHua,LIUHua,HUANGWenfang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanProvincialAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

ObjectiveTo investigate the SCCmec types of clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE).MethodsEighty-four strains of clinically isolated Staphylococcus epidermidis identified by the fully automatic microbiological identification system were collected and performed the MRSE identification by PCR for amplifying esp and mecA genes and SCCmec typing.Its distribution characteristics were analyzed.ResultsEsp gene was amplified in 84 strains and the detection rate of mecA was 76.19% (64/84),in which the MRSE detection rates in blood,sputum,urine and wound secretion were 76.8%，68.8%，100% and 71.4% respectively.The multiple PCR amplification displayed that among 64 strains of MRSE,19 strains were SCCmec simple type,in which 19 strains were SCCmec type Ⅰ and 3 strains were SCCmec type Ⅲ;42 strains were SCCmec mixed type,in which 2 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅱ,14 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅲ,12 strains were SCCmec mixed type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ,5 strains were SCCmec mixed type Ⅱ and Ⅲ,a strains were and SCCmec mixed type Ⅲ and Ⅳ.ConclusionThe SCCmec type in clinically isolated MRSE shows obvious diversity and its majority is SCCmec mixed type.

methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis;SCCmec type；MRSE；diversity

杨永长，男，主管技师，主要从事临床微生物研究。△

,E-mail：huangwf2002@21cn.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.026

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1673-4130(2016)16-2273-03

2016-01-24

2016-03-29)