外周血及蜕膜组织中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例和炎症因子原因不明复发性流产的关系研究

楼向明　刘文华　费小阳

[摘要]目的：探究外周血及蜕膜组织中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例以及相关炎症因子对原因不明复发性流产的影响。方法：选取2014年5月至2015年5月就诊于我院门诊的原因不明复发性流产（URSA）患者90例为观察组，并选取同期在妇产科门诊手术室的行人工流产手术的正常患者90例为对照组：分析两组患者的一般资料、外周血及蜕膜组织中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例、调节性T细胞特异调节因子Foxp3和EBi3的表达以及血清炎症因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，研究其相关性。结果：与正常妊娠组相比，反复流产组外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例明显降低，Foxp3和EBi3因子mR-NA的表达水平明显降低，且无论URSA患者或者是正常对照组，蜕膜中各因子的表达均高于外周血中的表达，外周血TNF-α、IL-2水平明显升高，而IL-6和IL-10水平要明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：蜕膜中各因子的表达均高于外周血中的表达提示妊娠过程的主要免疫反应部位是“母-胎界面”，Treg细胞比例、Treg细胞因子和Th2型因子IL-6、IL-10水平可能参与妊娠的维持，调控“母-胎界面”局部免疫耐受。对于复发性流产的发病过程具有一定的影响作用。

[关键词]CD4⁺CD25⁺调节性T细胞；原因不明复发性流产；炎症因子

[中图分类号]R714.21 [文献标志码]A

近年来，复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的发病率正在逐年增加，RSA是指连续发生2次及2次以上的自然流产，其发生率在1%～5%左右，使得患者的身心健康、日常生活和工作都受到极大的负面情绪影响。RSA主要与解剖、内分泌、感染、遗传以及外界环境等因素相关，然而临床上仍有50%的复发性流产原因不明，称为原因不明性复发性流产（un-explmned recurrent spontaneous aboartion，RSA），免疫微环境失调在其中扮演重要的角色。研究表明，Th1型因子（如IL-2、TNF-α等）和Th2型因子（如IL-6、IL-10等）构成了蜕膜局部细胞因子网络，CD4⁺T辅助细胞亚群中Th1/Th2细胞的比例在免疫平衡的维持中起重要作用。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Treg细胞）主要发挥免疫负调节的作用，起抗炎和维持自身免疫耐受的作用，Foxp3和EBi3是Treg细胞的特异性调节因子，对Treg细胞的发育和免疫抑制功能的维持具有重要作用。本研究通过检测URSA患者和正常早孕妇女外周血Th1型因子和Th2型因子水平、外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例的变化以及Foxp3和EBi3的表达水平，探讨相关性，为URSA的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例来源于2014年5月至2015年5月就诊于我院门诊的URSA患者90例和同期在妇产科门诊手术室的行人工流产手术的正常患者90例。URSA病例纳入标准：（1）年龄<40岁；（2）有2次或2次以上自然流产史；（3）夫妇双方身体健康，且复发性流产病因经普通检查无法明确：（4）入组患者均知情同意。排除标准：（1）内分泌和免疫相关疾病；（2）器质性病变及感染性因素；（3）家族遗传病及近亲结婚史；（4）服用药物或有害物质接触史。对照组病例纳入标准：（1）年龄<40岁：（2）妊娠小于12周；（3）B超检查证实胚胎发育正常。（4）夫妇双方身体健康。排除标准：（1）既往无自然流产以及死胎史（2）患有器质性病变、内分泌和免疫相关疾病；（3）感染性疾病以及肝肾疾病病史。观察组：年龄20～38岁，平均（27.5±3.1）岁，流产次数2～7次，平均（3.1±1.2）次，流产时平均孕周（8.1±0.8）周，月经第3d性激素五项水平正常；对照组：年龄19～39岁，平均（28.4±3.5）岁，平均孕周（7.9±1.5）周，月经第3d性激素五项处于正常水平。经统计学分析，两组患者的年龄、孕周、月经第3d性激素五项等一般资料均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

用抗凝管抽取两组患者外周静脉血，离心分离血清与血细胞，收集两组患者行人工流产术时取出的蜕膜，酶联免疫双抗体夹心法（ELISA）法测定血清炎症因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，逆转录一聚合酶链反应法（RT-PCR）检测患者外周血及蜕膜组织中Foxp3和EBi3因子mRNA的表达，双荧光标记流式细胞技术检测外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例。

1.3 观察指标

分析两组患者的一般资料、外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例、Treg细胞特异调节因子Foxp3和EBi3的表达以及血清炎症因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，详细记录后做出对比分析，研究其相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件对所得数据进行统计分析，定性资料采用独立样本R×C列联表资料的x²检验；定量资料，以均数±标准差（x±s）表示，采用配对设计资料的t检验或两独立样本资料的t检验，按α=0.05的检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况比较

纳入样本为就诊于我院门诊的URSA患者90和同期在妇产科门诊手术室的行人工流产手术的正常患者90例。两组一般资料具有均衡性（P>0.05）。见表1。

2.2 两组外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例比较

与正常妊娠组相比，反复流产组外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例明显降低，蜕膜中Treg细胞比例高于外周血，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。意义（P<0.05）。见表3。

2.3 两组外周血及蜕膜组织中Foxp3和EBi3因子mRNA的表达水平比较

与正常妊娠组相比，反复流产组外周血及蜕膜组织中Foxp3和EBi3因子mRNA的表达水平明显降低，蜕膜组织中Foxp3和EBi3因子mRNA表达水平高于外周血，差异有统计学

2.4 两组外周血及Th1型因子和Th2型炎症因子水平比较

与正常妊娠组相比，反复流产组外周血TNF-α、IL-2水平明显升高，而IL-6和IL-10水平要明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

URSA的发病机制尚未完全阐明，目前存在较多的探索和尝试性的治疗，结果的矛盾导致巨大的争议。研究表明，妊娠阶段是一个特殊的、复杂的生理阶段，伴随着在心理、生理和免疫功能的变化，我们可以将胎儿看作是在母体内生长、发育和成形的一种同种的抗原，并在母体免疫应答的保护作用下生长，一直持续到胎儿顺利地分娩，这种使胎儿不被排斥的现象是由很多因素共同作用产生的效果，分布在母胎界面的T细胞（Th细胞）包括Th1/Th2型细胞因子成为研究者的观察目标，最近的研究发现，这种模式不能完全反映体内细胞因子网络，胎儿的植入过程从粘连、定位、血管生成、侵入过程涉及复杂和精确的调节。有学者认为，并非仅有Th1/Th2类细胞因子参与了免疫耐受的形成，Treg细胞以及Treg细胞因子对母-胎免疫耐受的形成起着至关重要的作用。

Th1型免疫反应与Th2两型免疫反应主要调节调控“母-胎界面”局部免疫耐受，将耐受与排斥现象保持在一个相对平衡的状态中。在怀孕初期，TNF-α、IL-2作为Th1型细胞因子代表，调控细胞的增殖、分化、衰老、凋亡细胞增殖以及机体能量代谢，为胎儿的生长发育提供了相对良好的环境。At-slan等发现Th1型细胞因子促进孕妇体内的激素合成包括孕酮和人绒毛膜促性腺激素，促进胎盘的植入；然而过高的Th1型细胞因子水平对于胎儿发育过程也构成威胁性，在很大程度上增加了胚胎植入过程的难度。作为Th2型细胞因子，研究发现IL-6发现通过刺激B细胞影响母体的免疫系统降低排斥作用，胚胎进入子宫后，母胎之间适应性与相容性则受到IL-10的调控。Treg通过细胞间接触抑制和分泌抑制性细胞因子等抑制传统T细胞的活化从而维持机体内环境的稳定并诱导移植物的耐受。Foxp3是Treg细胞的特异性转录调节因子，对Treg细胞在胸腺内的发育、在外周的分布以及免疫抑制功能的维持具有重要作用，Foxp3含量可以调控母胎界面免疫耐受的形成，促使妊娠向好的结局发展。

本研究中发现，与正常妊娠组相比，反复流产组外周血及蜕膜组织中Treg细胞比例明显降低，Foxp3和EBi3因子mRNA的表达水平明显降低，且无论URSA患者或者是正常对照组，蜕膜中各因子的表达均高于外周血中的表达，外周血TNF-α、IL-2水平明显升高，而IL-6和IL-10水平要明显降低蜕膜中各因子的表达均高于外周血中的表达提示妊娠过程的主要免疫反应部位是“母-胎界面”，Treg细胞比例、Treg细胞因子和Th2型因子IL-6、IL-10水平可能参与妊娠的维持，调控“母-胎界面”局部免疫耐受，于复发性流产的发病过程具有一定的影响作用。

综上所述，URSA的发生和发展是一个极其复杂和综合的免疫学过程，我们需要从不同角度如Th1/Th2型细胞因子、Treg细胞以及Treg细胞因子等方面对URSA患者的治疗进行更多的研究，从而确立治疗URSA的有效方法。

（收稿日期：2015-08-05）