大曲蛋白酶对固态酿酒发酵的影响

向双全，黄应予，刘丽娟，王蕾，候花宁，周莹莹

（1.甘肃省固态发酵工程技术研究中心，甘肃徽县742308；2.金徽酒股份有限公司技术中心，甘肃徽县742308）

大曲蛋白酶对固态酿酒发酵的影响

向双全1，2，黄应予1，2，刘丽娟2，王蕾2，候花宁2，周莹莹2

（1.甘肃省固态发酵工程技术研究中心，甘肃徽县742308；2.金徽酒股份有限公司技术中心，甘肃徽县742308）

在传统浓香型固态酿酒工艺的基础上，采用响应面法对影响酿酒出酒率的关键响应因子进行了研究和探讨。用统计学方法建立了出酒率与糟醅酸度、糟醅水分、大曲蛋白酶活力组成的二次多项式数学模型，并通过分析模型方程和响应曲面得到本试验方案固态酿酒最佳条件，即糟醅酸度为1.9度，糟醅水分含量为53%，大曲蛋白酶活力为14 U/g。在此最佳条件下，出酒率达到47.3%。

酸度；水分；大曲蛋白酶；出酒率

大曲蛋白酶是一种复合型蛋白酶，具有在酸性、中性、碱性条件下保持酶活力的特点，它是制曲过程多种微生物的代谢产物［1-5］。在固态酿酒发酵过程中大曲蛋白酶具有促进原料溶解、分解蛋白质、生成氨基酸、提供氮源、促进微生物繁殖生长，降解酵母菌体、提高原料利用率、提供生香前驱物质和风味组分，协同其他微生物共发酵、抑制大量杂醇油的生成、提高原酒产量和质量等重要作用［6-10］。

在传统固态白酒酿造过程中经常会出现原料利用率低，发酵结束后糟醅酸度、残糖、残余淀粉越来越高、出酒率和质量下降的恶性循环状态。究其主要原因：一方面是蛋白质对淀粉的包裹作用，阻碍大曲液化酶、糖化酶对淀粉的充分水解；另一方面是由于蛋白质未被水解，发酵需要的氮源严重缺乏，影响酿酒微生物的繁殖代谢，特别是酵母菌对氮源的需求［11］。大曲中蛋白酶活力适当的情况下，包裹淀粉的蛋白质层结构会被破坏，使淀粉被糖化；另一方面蛋白质水解增加了氮源，有利于酿酒微生物，特别是酵母菌的代谢繁殖，糟醅的恶性状况会逐渐改善，达到正常生产水平。本研究通过Design Expert 8.05b（Box-Behnken）试验设计进行响应面试验［12-14］，优化了大曲蛋白酶在固态酿酒中的最佳酸度和水分配合发酵条件，充分发挥其在固态酿酒发酵过程中的作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

中温大曲：宜宾市长兴酒厂；酸性蛋白酶（10万U/g）：山东隆大科技公司；高粱、大米、糯米、玉米、小麦、稻壳：湖北梦晶米业公司。

蒸馏水、福林试剂、碳酸钠、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、氢氧化钠、盐酸、乳酸、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

T6紫外-可见分光光度计：普析通用公司；XPE105电子天平：梅特勒-托利多公司；DK-S14恒温水浴锅、DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱、SHP-150生化培养箱：上海森信试验仪器有限公司；FZ102微型植物粉碎机：山东泰斯特仪器有限公司；5 L蒸酒设备：自制。

1.3方法

1.3.1工艺流程

粮粉→加水润粮→加入稻壳混匀→入甄蒸煮→出甄检测糟醅水分、酸度→调节糟醅水分、酸度→加入调好蛋白酶活力的曲粉→装袋密封→放入培养箱恒温发酵→取出蒸酒

1.3.2操作要点原料粉碎

将5种粮食粉碎，过20目筛；按高粱∶大米∶糯米∶小麦∶玉米比例为38%∶22%∶20%∶12%∶8%进行混合。大曲粉碎后过20目筛。

取1 kg混合粮粉，加入600 mL温水润粮30 min，加入250 g熟稻壳，混匀，在蒸酒设备上大气蒸煮70 min后出甄，出甄后加入80℃热水。通过调整加入热水的量来控制发酵糟醅水分；同时通过在热水中加入不同量的乳酸来控制发酵糟醅的酸度。加入热水焖润15 min后摊开糟醅冷却，当温度降至20℃时加入调好蛋白酶活力的大曲粉250g。最后收堆密封，放入27℃培养箱中恒温发酵10 d后取出发酵后糟醅。

1.3.3单因素试验

糟醅酸度对出酒率的素影响：设定糟醅水分含量为50%，大曲蛋白酶活力为10.0U，分别调整糟醅酸度为1.4度、1.7度、2.0度、2.3度、2.6度、2.9度，考察糟醅酸度对出酒率的影响。糟醅酸度的定义为10 g糟醅消耗0.10 mol/L氢氧化钠标准溶液的毫摩尔数为糟醅酸度，消耗1 mmol氢氧化钠标准溶液为1度。

糟醅水分对出酒率的影响：设定糟醅酸度为1.5度，大曲蛋白酶活力为10.0 U，分别调整糟醅水分含量为46%、48%、50%、52%、54%、56%，考察糟醅水分含量对出酒率的影响。

大曲蛋白酶活力对出酒率的影响：设定糟醅水分含量为50%，糟醅酸度为1.5度，分别调整大曲蛋白酶活力为5.0 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g、30 U/g，大曲蛋白酶活力对出酒率的影响。大曲蛋白酶活定义为1 g（干质量）大曲中所含的蛋白酶在40℃、pH值为3.0的条件下1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位（U/g）［15］。

1.3.4响应面试验

采用Design Expert 8.05b软件设计试验，选取发酵糟醅水分、糟醅酸度、大曲蛋白酶活力为3个评价因素，以出酒率为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验，因素与水平见表1。

表1　Box-Behnken试验因素水平及编码Table 1 Factors and coded levels of Box-Behnken design

1.3.5测定方法

出酒率：糟醅发酵10d后取出拌糠蒸馏，用500 mL量筒接酒，同时在量筒中放入温度计和酒精计，当量筒中的酒精度降至60%vol时，停止接酒，记录蒸出酒体积，按60%vol酒精度计算出酒率。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1糟醅酸度对出酒率的影响

糟醅酸度对出酒率的影响结果见图1。由图1可见，糟醅酸度为1.4～2.0度时，随着酸度的增加，酿酒微生物繁殖代谢能力逐渐增强，出酒率也增加；当糟醅酸度＞2.0度时，酿酒微生物繁殖代谢能力减弱，出酒率开始下降。因此，确定出酒率最佳的糟醅酸度为2.0度。

图1　糟醅酸度对出酒率的影响Fig.1 Effect of fermented grains acidity on Baijiuyield

2.1.2糟醅水分含量对出酒率的影响

糟醅水分含量对出酒率的影响见图2。由图2可见，糟醅水分含量在46%～52%的范围内时，随着水分含量的增加，出酒率也增加；当水分含量＞52%时，出酒率开始下降。因此，确定出酒率最佳糟醅水分为52%。

图2　糟醅水分含量对出酒率的影响Fig.2 Effect of fermented grains moisture onBaijiuyield

2.1.3大曲蛋白酶活力对出酒率的影响

大曲蛋白酶活力对出酒率的影响见图3。由图3可见，大曲蛋白酶活力在5～15 U/g的范围内时，随着大曲蛋白酶活力的增加，出酒率也增加；当大曲蛋白酶活力＞15 U/g时，出酒率开始下降。因此，确定出酒率最佳的大曲蛋白酶活力条件为15 U/g。

图3　大曲蛋白酶活力对出酒率的影响Fig.3 Effect of Daqu protease activity onBaijiuyield

2.2响应面试验设计和显著性分析

试验设计和数据利用DesignExpert8.05b（Box-Behnken）软件处理，用F（Fischer）检验评价数学模型方程的显著性，方程的拟合性由决定系数R2确定，以确定固态发酵过程中糟醅酸度、水分以及大曲蛋白酶活力的最佳配比，试验设计及结果见表2。利用Design Expert 8.05b软件对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表2　Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通过对数据进行多元回归拟合，得到的拟合全变量二次回归方程模型为：Y=2885.4-3.93A+1.84B-0.59C-0.30AB+ 0.35AC-0.17BC-8.87A2-3.29B2-4.34C2。用该回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，决定系数R2=0.973 2，说明了97.32%的响应值变化是由该模型决定的，调整后决定系数值为0.9384说明试验中出酒率与模型预测值有93.84%的一致性，由此表明该模型对试验结果能进行较准确的预测。模型的显著水平P＜0.01，此时二次回归方程是极显著的，方程对试验拟合较好，因此可用此模型对响应面进行分析和预测。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断在本试验工艺参数中，糟醅酸度、二次项均达到极显著水平（P＜0.01），糟醅水分含量对结果影响显著（P＜0.05），交互项对果影响不显著（P＞0.05）。由表3可知A的P值为0.001，B的P值为0.000 2，C的P值为0.014 1，说明各自变量在设定的取值范围内单因素对出酒率的影响顺序为A＞B＞C。失拟项P=0.1379＞0.05，未达到显著水平，表明试验设计合理，该模型能准确描述各变量因素与响应值之间的关系。

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3响应面的分析与优化

通过模型方程得出的响应曲面及等高线图，结果见图4。

由图4可知，AC两因素间的交互作用大于AB以及BC之间的交互作用；其结果与拟合方程中交互项系数的绝对值大小关系一致。由图4可以看出，等高线均呈椭圆形，说明各两因素间的交互作用较强。由此可以说明在固态酿酒过程影响出酒率因素中，大曲蛋白酶活力的影响不可忽视，在固态酿酒工艺参数范围内大曲蛋白酶活力仅次于糟醅酸度对出酒率的影响，且大于糟醅水分对出酒率的影响，由此试验可以认为大曲蛋白酶活力在固态酿酒过程中的重要作用及地位。

图4　糟醅酸度、糟醅水分含量、大曲蛋白酶活力交互作用对出酒率影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity onBaijiu yield

2.4模型验证

对拟合的二次多项式回归方程分别求A、B、C的偏导数，可得各个因素的极值点：A=1.87，B=52.77，C=14.37。

即糟醅酸度1.87度，糟醅水分52.77%，大曲蛋白酶活力14.37 U/g。为方便实际操作，调整糟醅酸度为1.9度，糟醅水分为53%，大曲蛋白酶活力为14 U/g，在此条件下进行3次平行试验，出酒率平均值为47.3%。

3　结论

本试验根据传统固态酿酒工艺控制要点的基础上，固定其他工艺要素，选择糟醅酸度、水分含量、大曲的蛋白酶活力3个因素，应用响应面法对3因素进行优化，建立了固态酿酒出酒率与糟醅酸度、水分含量、大曲蛋白酶活力组成的二次多项式数学模型，并通过分析模型方程得到本试验方案固态酿酒最佳条件，即糟醅酸度为1.9度，糟醅水分含量为53%，大曲蛋白酶活力为14 U/g，在此条件下的出酒率为47.3%。

［1］张学峰，刘达玉，夏兵兵.酒用酸性蛋白酶在甜酒酿生产中的应用［J］.中国酿造，2009，28（2）：122-124.

［2］郭佰兴，张志凌，刘海滨.酸性蛋白酶在酒精行业的推广应用［J］.中国酿造，2013，32（1）：65-67.

［3］赵华，赵树欣，张维.酒精发酵中应用酸性蛋白酶的研究［J］.食品与发酵工业，1996，23（2）：26-28.

［4］鲁珍，余中华，李恩中.酱香型高温大曲酶系的研究进展［J］.食品安全导刊，2016（9）：51-53.

［5］马特，宋连宝，赵辉.白酒窖泥中蛋白酶产生菌的筛选及复配［J］.食品科学，2016，37（7）：146-151.

［6］毛祥，黄丹，沈才萍，等.酱香型大曲中产淀粉酶菌的分离鉴定及发酵特性研究［J］.中国酿造，2015，34（12）：24-27.

［7］胡宝东，王晓丹，王婧，等.酱香型大曲生产工艺与大曲品质的关系研究［J］.食品工业，2016（2）：260-264.

［8］窦晓，杨建刚，马莹莹，等.华根霉在酿酒中的研究进展［J］.食品与发酵工业，2015，41（4）：246-250.

［9］隗程峰，姚晓玲，朱正军，等.液态麦曲配方研究［J］.中国酿造，2015，34（4）：93-96.

［10］周世水.控制啤酒中高级醇含量的研究［J］.酿酒，2005（3）：51-53.

［11］陈飞，吴胜文，张志刚.蛋白酶在酒类生产中的应用现状［J］.酿酒，2010（6）：9-11.

［12］刘元涛，董学前，王伟，等.鞘氨醇单细胞发酵生产韦兰胶培养基的优化研究［J］.中国酿造，2016，35（1）：73-77.

［13］薛秀恒，曹玉林，杨晓飞，等.荞麦酸奶发酵工艺研究及其质量评价［J］.食品与发酵工业，2016，42（1）：81-86.

［14］李理，满朝新，刘少敏，等.植物乳杆菌产氨基丁酸的影响因素及其代谢机制［J］.食品科学，2015，36（7）：84-89.

［15］上海市酿造科学研究所.SB/T 10317—1999蛋白酶活力测定法［S］.北京：中国标准出版社，1999.

XIANG Shuangquan1，2，HUANG Yingyu1，2，LIU Lijuan2，WANG Lei2，HOU Huaning2，ZHOU Yingying2
（1.Gansu Province Solid State Fermentation Engineering Technology Research Center，Huixian 742308，China；2.Provincial Technology Center of Jinhui Liquor Co.，Ltd.，Huixian 742308，China）

On the basis of traditional flavor type of solid-state fermentation process ofBaijiu，the key factors affectingBaijiuyield were researched by response surface methodology.Quadratic polynomial mathematical model was established betweenBaijiuyield and fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity by statistical method，and the optimal solid-state fermentation process was determined by analyzing model equations and response diagram as follows：fermented grains acidity 1.9，moisture 53%，Daqu protease activity 14 U/g.Under the optimum conditions，the Baijiuyield was 47.3%.

acidity；moisture；Daqu protease；liquor yield

TS261.1

0254-5071（2016）06-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.021

2016-04-23

甘肃省科技厅科技计划项目（144JTGK220）

向双全（1979-），男，工程师，本科，研究方向为白酒风味成分和白酒酿造。