吉西他滨、顺铂及香菇多糖对Lew is肺癌细胞株抑制作用的实验研究

马维娜　　孟拥军

上海市嘉定区中心医院药剂科，上海　201800

吉西他滨、顺铂及香菇多糖对Lew is肺癌细胞株抑制作用的实验研究

马维娜孟拥军

上海市嘉定区中心医院药剂科，上海201800

目的 研究吉西他滨、顺铂、香菇多糖三种药物单独使用及联合使用对Lewis肺癌细胞株的增殖抑制作用。方法 分别使用不同浓度的吉西他滨（0.5、1、2、5、8、10、12μg/mL）、顺铂（1、2、4、8、10、16、20μg/mL）、香菇多糖（50、100、150、200、250、300、400μg/mL）单独及联合处理Lewis肺癌细胞株，24 h后MTT法测定细胞生长抑制作用，应用金氏公式进行联合用药分析。结果 吉西他滨、顺铂、香菇多糖对Lewis肺癌细胞均有不同程度的增殖抑制作用，两种或三种药物联用后对Lewis肺癌细胞株的抑制率显著增加，其中8μg/mL的吉西他滨与10μg/mL的顺铂和250μg/mL香菇多糖联用时，其抑制率近似于10μg/mL的吉西他滨和16μg/mL的顺铂两药联用；而当香菇多糖的浓度增加至200μg/mL时，三药联用的抑制率明显高于吉西他滨和顺铂两组药物联用（P＜0.05）。结论 香菇多糖可增强吉西他滨和顺铂对Lewis肺癌细胞的增殖抑制作用，表现为协同效应，并且联用后能够减少常规化疗药物的用量。

吉西他滨；顺铂；香菇多糖；Lew is肺癌细胞株；MTT法

［Abstract］Objective To investigate the anti-proliferative effect of single use of Gemcitabine，Cisplatin，Lentinan and combination of them on Lewis lung cancer cell lines.Methods Lewis lung cancer lineswere treated with different concentrations of Gemcitabine（0.5，1，2，5，8，10，12μg/mL），Cisplatin（1，2，4，8，10，16，20μg/mL），Lentinan（50，100，150，200，250，300，400μg/mL）and combination of them separately.After 24 hours，the inhibitory effects weremeasured with MTT assay and Jin formula was applied to analyze the combination effect of the drugs.Results Gemcitabine，Cisplatin and Lentinan all showed the anti-proliferative effects on Lewis cancer cell lines in varying degree.The inhibitory rates of any two or three drugs of them were significantly higher，among which，the inhibitory rate of combination use of 8μg/mL Gemcitabine，10μg/mL Cisplatin and 250μg/mL Lentinan was close to that of 10μg/mL Gemcitabine and 16μg/mL Cisplatin.When the concentration of Lentinan increased to 200μg/mL，the suppression rate of the tumor in three-drug regimen group was higher than that in the Gemcitabine combined with Cisplatin group（P＜0.05）.Conclusion Gemcitabine，Cisplatin shows the anti-proliferative effect on Lewis lung cancer cell lines distinctly，and the drugs have better cooperative effect combined with Lentinan，furthermore，the combined use can reduce conventional chemotherapy doses.

［Key words］Gemcitabine；Cisplatin；Lentinan；Lewis lung cancer cell line；MTT assay

肺癌是导致人类癌性死亡的首位疾病，全球每年因肺癌死亡的人数超过100万人，其中80%～90%的患者为非小细胞肺癌［1］。在肿瘤化疗过程中，化疗所产生的不良反应以及肿瘤细胞的耐药性经常限制其疗效和应用，采用联合用药的方式可以使药物对肿瘤细胞发挥最大限度的杀伤，近年来常采用中西药联用的方法［2］。吉西他滨+顺铂（GP疗法）治疗非小细胞肺癌是目前临床上常见的一种化疗方案［3］。吉西他滨是阿糖胞苷类抗代谢抗癌药，主要作用于DNA合成期和晚G1期，并可阻止细胞由G1期进入S期［4］，体外实验中发现其对多种鼠及人的肿瘤细胞有疗效，并且具有较强的酶亲和力和细胞膜穿透性，此外由于其特殊的药代动力学特征，致使药物在体内的作用时间延长，从而增加疗效［5］。顺铂属细胞周期非特异性药物，进入体内后，可与DNA链上的碱基形成交叉联结，从而破坏DNA的结构和功能，具有抗瘤谱广等特点，对肺癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、黑色素瘤、淋巴肉瘤等具有较好的疗效［6］。香菇多糖是从优质香菇的子实体中提取而得，是香菇的主要组成部分。香菇多糖注射液具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能［7］，是一种具有免疫调节作用的抗肿瘤中药注射剂，能够通过作用于各种免疫细胞（包括巨噬细胞、树状突细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞）刺激免疫系统来增强免疫反应［8］，目前在临床抗肿瘤方面的应用较为广泛，研究显示香菇多糖能增强放疗、化疗作用［9］。本研究采用吉西他滨、顺铂及香菇多糖单独用药，吉西他滨和顺铂两药联用，以及香菇多糖联合吉西他滨和顺铂三药联用后，分别检测其对Lewis肺癌细胞的增殖抑制作用，以期寻找治疗非小细胞肺癌更加有效的组合方案，为进一步研究三种药物的相互作用机制提供基础，并为临床应用提供可行性依据。

1　材料与方法

1.1药物与主要试剂

吉西他滨为江苏豪森药业股份有限公司产品，批号为140310；顺铂为江苏豪森药业股份有限公司产品，批号为150402；香菇多糖为江苏康缘药业股份有限公司产品，批号为150807；Lewis肺癌细胞购于中国科学院（上海）细胞库；胎牛血清为杭州四季青生物工程研究所产品；DMEM培养液购自上海一飞生物技术有限公司；0.25%胰酶为Hyclone公司产品；二甲基亚砜（DMSO）和噻唑蓝（MTT）试剂盒为Sigma公司产品。

1.2细胞系及培养

在37°C、5%CO2的培养箱中，用含1%双抗（青霉素100 kU/L、链霉素100 kU/L），10%胎牛血清的DMEM培养基培养Lewis肺癌细胞株，2～3 d换液1次，倒置显微镜观察生长情况，当细胞密度达到70%～80%时用0.25%胰酶消化，以1∶3比例传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.3细胞增殖检测（MTT法）

取对数生长期的Lewis肺癌细胞调整浓度至5× 104个细胞/mL，接种于96孔板，每孔180μL，置于37°C、5%CO2细胞培养箱中培养4 h，分为空白对照组（仅含培养基）、对照组（细胞+培养基）和各种不同浓度药物的实验组。实验组分单药组：将三种单药的7个不同浓度分别加在96孔板内，每孔加药量20μL，使吉西他滨的终浓度为0.5、1、2、5、8、10、12μg/mL，顺铂的终浓度为1、2、4、8、10、16、20μg/mL，香菇多糖的终浓度为50、100、150、200、250、300、400μg/mL；联合用药组分为吉西他滨+顺铂组、吉西他滨+顺铂+香菇多糖组，联合用药组中吉西他滨、顺铂和香菇多糖的终浓度与单用药组相同，按浓度梯度依次加药，每组设5个复孔，在CO2孵箱中培养24 h后吸去上清液，用PBS溶液漂洗3遍，加入200μL DMEM培养基，每孔中加0.5%MTT 20μL继续培养4 h后，将96孔板置于离心机中，1000 r/min离心5min，小心吸取并弃上清液，加入180μL二甲基亚砜溶液充分溶解结晶，于自动酶标读数仪490 nm处测定各孔吸光度（A），并计抑制率及IC50［10］。实验重复3次，取平均值。

肿瘤细胞抑制率（IR）=［1-（给药组A值-空白组对照组A值）/（阴性对照组A值-空白对照组A值）］。联合用药对细胞增殖抑制率参照金氏公式判断［11］：Q= E（a+b）/（Ea+Eb-Ea×Eb），其中E（a+b）为两药合用的抑制率，Ea为A药单用的抑制率，Eb为B药单用的抑制率。0.85≤Q＜1.15为两药相加作用（+），Q≥1.15为两药协同作用（++），0.55≤Q＜0.85为两药拮抗作用（-），Q＜0.55为明显拮抗作用（--）。

1.4统计学方法

用SAS9.3软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三种药物单用对Lew is肺癌细胞株的抑制作用

实验结果表明吉西他滨、顺铂、香菇多糖三种药物单独使用对Lewis肺癌细胞均有不同程度的抑制作用，抑制率的大小呈剂量依赖性。其中吉西他滨和顺铂的作用较强，5μg/mL吉西他滨和10μg/mL顺铂对Lewis肺癌细胞24 h抑制率分别为（47.33±4.94）%和（45.31±2.06）%，而香菇多糖的作用相对较弱，需要较高的浓度才能产生明显的抑制率。吉西他滨、顺铂和香菇多糖作用24 h后对Lewis肺癌细胞株的IC50分别为4.40、10.97μg/mL和334.09μg/mL。见表1及图1～3。

2.2两种及三种药物联用对Lew is肺癌细胞株的抑制作用

吉西他滨和顺铂两药联用组作用24 h后对Lewis肺癌细胞株的抑制率明显高于单独用药组（P＜0.05），通过计算Q值，低浓度的两组药物联用（吉西他滨浓度为0.5、1、2μg/mL，顺铂浓度为1、2、8μg/mL）表现为协同作用，当浓度增加后两组药物联用（吉西他滨浓度为5、8、10、12μg/mL，顺铂浓度为8、10、16、20μg/mL）表现为相加作用，见表2及图4。吉西他滨顺铂香菇多糖三药联用组中吉西他滨和顺铂的浓度与两药联用组一致，当香菇多糖的加药浓度为50、250、300、400μg/mL时，三药联用组的抑制率明显大于两药联用组（P＜0.05），见表3及图4。

表1　吉西他滨、顺铂、香菇多糖对Lew is肺癌细胞株的抑制作用（%，±s）

表1　吉西他滨、顺铂、香菇多糖对Lew is肺癌细胞株的抑制作用（%，±s）

组别　　抑制率　IC50（μg/mL）吉西他滨组（μg/mL）0.5 4.40 12581 0 12顺铂组（μg/mL）28.24±3.32 30.01±4.24 32.67±3.38 47.33±4.94 68.12±3.01 70.50±1.98 71.58±2.05 10.97 12481 0 16 20香菇多糖组（μg/mL）50 100 150 200 250 300 400 4.26±2.65 10.74±2.58 21.67±3.27 32.93±3.58 45.31±2.06 61.17±4.01 73.87±3.84 334.09 11.8±3.25 17.45±4.01 23.47±3.58 27.94±2.34 35.69±4.37 51.67±5.24 64.32±2.11

图1　吉西他滨对Lewis肺癌细胞株浓度与抑制率的关系

图2　顺铂对Lewis肺癌细胞株浓度与抑制率的关系

图3　香菇多糖对Lew is肺癌细胞株浓度与抑制率的关系

表2　两种药物联用对Lewis肺癌细胞株的抑制作用（%，x±s）

3　讨论

肺癌是我国常见恶性肿瘤，目前临床常用吉西他滨加顺铂（GP方案）治疗非小细胞肺癌，并取得较好疗效［12-13］。但化疗引起的不良反应较多，增加患者痛苦，导致患者生活质量下降，因此提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物的不良反应有重要临床价值［14］。近年来，有研究人员将香菇多糖与吉西他滨和顺铂联用，用于对非小细胞肺癌的治疗，结果显示与GP方案比较，联用药物后有更好的疗效，能够明显改善患者生活质量，提高生存期，并可耐受其毒副作用［15-16］。

香菇多糖是从真菌香菇的子实体中分离到的β-1，3-葡聚糖，是一种具有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂，通过非特异性激发激活宿主产生抗肿瘤免疫应答，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的［17］。体外实验和临床报道显示其具有抗肿瘤和增强免疫功能的作用，目前临床应用已显示出了较好的疗效［18］。有体内实验采用MTT法考察香菇多糖对多种肿瘤细胞的细胞毒作用，研究结果表明香菇多糖对K-562、PC-3、HepG2和A-549肿瘤细胞都具有一定的细胞毒性作用［19］，因此可以认为香菇多糖以其对肿瘤细胞的毒性作用，杀伤抑制肿瘤细胞，达到治疗部分肿瘤的目的。本研究也得到了以上结论，实验结果提示吉西他滨、顺铂和香菇多糖对Lewis肺癌细胞均有一定的增殖抑制作用，两种或三种药物联用后对Lewis肺癌细胞株的抑制率显著增加。本研究还发现三药联用时，较低浓度的香菇多糖（100、150μg/mL）与吉西他滨和顺铂联用，对Lewis肺癌细胞的抑制作用没有显著性差异，而当香菇多糖的浓度增加至200μg/mL时，三药联用的抑制率明显高于吉西他滨和顺铂两组药物联用（P＜0.05），且与250μg/mL香菇多糖联用后8μg/mL的吉西他滨和10μg/mL的顺铂能够达到10μg/mL的吉西他滨和16μg/mL的顺铂两药联用的效果，由此本研究认为香菇多糖抗肿瘤作用具有最佳量效关系，当与化疗药物联用时能够明显提高对肿瘤细胞的抑制率，且香菇多糖作为一种生物调节剂，可以通过免疫系统直接或间接增强机体的抗肿瘤效应［20］。

图4　药物联用对Lewis肺癌细胞株的抑制作用

表3　三种药物联用对Lew is肺癌细胞株的抑制作用（x±s）

综上所述，三药联用具有明显的协同作用，可能与它们不同的抗肿瘤机制有关，三者联合应用可以通过互补而增强抗肿瘤效果。但由于香菇多糖属于中成药，含有多种成分且作用机制较为复杂，其机制在分子生物学方面尚未得到完全阐明，与常规化疗药物联用时的具体机制有待于进一步研究。

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Experimental study on the inhibitory effect of Gemcitabine，Cisplatin and Lentinan on Lewis lung cancer cell line

MAWeina MENG Yongjun
Department of Pharmacy，Jiading Central Hospital of Shanghai City，Shanghai201800，China

R734.2

A

1673-7210（2016）09（b）-0018-04

2016-05-03本文编辑：张瑜杰）

上海市嘉定区中心医院院级课题 （2014-12-01）。

马维娜（1983.5-），女，硕士；研究方向：药理学。

孟拥军（1971.7-），男，副主任药师；研究方向：药理学。