白及种子液体悬浮培养原球茎的研究

汤兴利， 李林华， 周义峰， 陈艺芳

(1.南京农业大学，江苏南京 210095；2.中国科学院南京分院东台滩涂研究院，江苏盐城 224200；3.安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖 241003；4.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014)



白及种子液体悬浮培养原球茎的研究

汤兴利1，2， 李林华3， 周义峰2，4， 陈艺芳1

(1.南京农业大学，江苏南京 210095；2.中国科学院南京分院东台滩涂研究院，江苏盐城 224200；3.安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖 241003；4.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014)

[目的]研究白及种子在液体悬浮培养条件下萌发的最佳条件，为快速繁殖白及幼苗提供技术支撑。[方法]研究不同光照条件、不同培养基和不同激素及浓度对白及种子萌发的影响。[结果]黑暗有利于白及种子萌发，1/2 MS适宜作为白及种子萌发基本培养基。植物激素对白及种子无菌萌发有一定的促进作用，其中，添加1.0 mg/L NAA对白及萌发促进效果最明显。[结论]在黑暗条件下，以1/2 MS+1.0 mg/L NAA为萌发培养基，白及种子萌发率高，萌发整齐一致，且原球茎生长速度一致。

白及；悬浮培养；原球茎

白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]为兰科白及属多年生宿根草本植物[1]，形态优美，具有很高的药用价值和观赏价值。白及在自然状态下主要采用分株繁殖，繁殖系数较低；虽然能产生大量种子，但白及是无胚乳种子，在自然条件下不易发芽。由于白及繁殖率低，无法适应规模化种植的需求[2-5]。目前针对白及繁殖的研究主要集中于种子无菌辅助育苗和组织培养，该技术可以在短时间内得到大量的实生苗，是白及生产上快速有效的途径[6-10]。

目前白及组织培养大多选用固体培养基，即将白及种子轻轻抖落在培养基表面，但由于白及种子呈粉末状，非常细小，操作时难以保证每个种子都能充分接触培养基，造成不同种子生长条件差异较大。同时由于白及种子细小，在固体培养基上播种时易将种子撒到一起导致种子萌发后过于密集，而幼苗在转接过程需要进行单株分离，过于密集会增加分离转接的难度，转接时易对幼苗造成二次伤害。笔者利用液体培养的方式对白及种子进行悬浮培养得到原球茎的方法进行研究，该方法可以让白及种子充分和液体培养基接触，并通过振荡培养的方式使白及种子充分分开，不会结成团块，后期转接时容易分离，不会对白及幼苗造成二次伤害。

1 材料与方法

1．1 试验材料 白及蒴果由安徽省芜湖市安徽中医药专科学校李林华老师提供，果实采集于安徽芜湖市南陵县丫山，经鉴定为兰科植物白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb. f.]的干燥成熟蒴果。试验于2014年9月至2016年6月在南京农业大学园艺学院组培中心进行。

1.2 主要仪器 FA1104分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，HS-1300-U超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，HV85全自动高压灭菌锅(日本Hirayama公司)，HY-8(A) 大容量振荡器(江苏盛蓝仪器有限公司)，奥林巴斯光学显微镜CX23(北京瑞科中仪科技有限公司)。

1．3 试验方法 白及蒴果采集后，于4 ℃冰箱贮藏，接种前从冰箱取出后用洗涤剂漂洗蒴果表面10～20 min，再用流水冲洗30 min。在超净工作台上用75%乙醇浸30 s，无菌水冲洗后经5%NaClO溶液消毒10 min，期间不停摇动，无菌水冲洗3～4遍，无菌滤纸吸干白及蒴果表面水分。用剪刀将蒴果顶端剪开，将种子抖落在不同处理液体培养基中。

液体培养基高温灭菌前调pH至5.6～5.8，121 ℃下灭菌30 min，每个处理接种5瓶，每瓶300～500粒种子。暗培养是将接种白及种子的液体培养瓶置于黑暗条件下培养并观察试验结果，其余处理的光照周期均为12 h/d，光照强度2 000～2 500 lx，培养温度均为(25±1)℃。将接种白及种子的液体培养瓶置摇床上振荡，防止白及种子在营养液中结块，摇床振荡频率为100 r/min。

1．4 观测项目与方法 白及种子接种于液体培养基后观察白及种子萌发情况和种子发芽率，根据发芽情况分为5级：+表示少数种子萌发且颜色淡黄绿色；++表示少于50%的种子萌发，少数种子冒尖且颜色黄绿色；+++表示约50%的种子萌发冒尖转绿；++++表示约75%的种子萌发，芽颜色鲜绿，种子中部膨大成球状；+++++表示约90%的种子萌发出芽，颜色翠绿且多数膨大成球状。

原球茎长度和粗度测定：将萌发的白及种子在无菌条件下随机取样置于光学显微镜下观察并测量白及原球茎的茎粗和芽长度，按照传统方法将物镜测微尺和目镜测微尺配合使用[11]。

2 结果与分析

2.1 不同激素条件对白及种子发芽的影响 由表1可知，白及种子接种后45 d，各液体培养基中白及种子均可达到4级以上。与1/2 MS培养基相比，添加1.0 mg/L NAA显著提高白及种子发芽率，并能促进白及组培苗生长。以1/2MS为基本培养基时，白及种子发芽速度快且一致，表明其生活力更旺盛；以MS为基本培养基有利于白及芽伸长，促进其快速生长。悬浮培养30 d种子发芽情况见图1。

表1 不同处理对白及种子萌发的影响

Table 1 Effects of different treatments on the seed germination ofB.striata

培养基Culturemedium发芽情况Germinationsituation15d30d45d1/2MS++++++++1/2MS+0.5mg/LNAA+++++++++1/2MS+1.0mg/LNAA++++++++++++++1/2MS+1.5mg/LNAA+++++++++++MS++++++++MS+0.5mg/LNAA+++++++MS+1.0mg/LNAA++++++++++++MS+1.5mg/LNAA++++++++++

图1 白及种子悬浮培养30 d表现Fig. 1 Performance of B. striata seeds under suspension culture for 30 d

2.2 不同光照条件对白及种子发芽的影响 将白及种子消毒后接种于1/2 MS+1.0 mg/L NAA培养基中，于黑暗和光照条件下培养，30 d后取样观察，结果见表2和图2。由表2和图2可知，黑暗条件更有利于白及种子发芽，光照条件下白及发芽率约80%，比黑暗条件下的发芽率低20%左右。同时，光照对白及原球茎的形成和早期生长也有明显的抑制作用。光照条件下，白及原球茎的长度、粗度仅为黑暗条件的30%和60%左右。因此，推测在外源激素和营养充足的条件下，光照条件虽然不是白及发芽及早期生长的决定性因子，但对其形成和生长性能产生重要影响，黑暗条件更有利于白及种子发芽、原球茎形成与生长。

表2 不同光照条件下白及发芽情况

注：a.黑暗条件下;b.光照条件下。Note: a. Dark condition; b. Light condition.图2 白及种子发芽情况Fig. 2 Germination situation of B. striata seeds

2.3_left不同激素及浓度对白及种子形成原球茎的影响 将白及种子消毒后接种于不同液体培养基中，于黑暗条件下培养30 d，结果见表3。由表3可知，不同培养基配方对白及种子萌发率和原球茎形成均有较大影响。6-BA明显抑制白及芽的伸长生长，对白及原球茎的增粗生长也有较明显的抑制作用。因此，在白及种子萌发过程中无须添加6-BA。最有利于白及种子萌发形成健康幼苗的最佳培养基是1/2MS +1.0 mg/L NAA。

表3 不同浓度激素对白及幼苗生长的影响

3 结论与讨论

兰科植物种子细小，成熟时种皮细胞质、细胞器退化消失，成为死细胞[12]。白及胚发育不完全，缺乏供给营养成分的胚乳，在自然条件下难以萌发。而无菌培养白及种子，必须提供其萌发所需的各种物质。该研究表明，1/2 MS作为种子萌发培养基可以提高其发芽势，高浓度盐离子影响细胞渗透势导致白及胚在吸水时膨胀速度较慢，故建议白及种子在萌发初期采用1/2MS培养基，且节省培养基成本。白及在萌发过程中添加一定的生长素有利于启动萌发，而6-BA在白及种子萌发过程中会增加细胞的分裂作用，显著增加白及数量，但明显抑制原球茎的增大和芽的伸长，而白及种子数量很多，并不是限制白及育苗的关键因素。因此，在白及种子液体发芽体系中不建议添加6-BA。

该研究发现，黑暗条件有利于白及种子萌发。在黑暗条件下培养的白及种子萌发率相对较高，且芽生长速度明显高于光照条件下。综合考虑，在黑暗条件下，以1/2 MS+1.0 mg/L NAA为萌发培养基培养获得白及原球茎。白及种子萌芽初期细小，不宜转接，因此，可以在培养瓶中直接添加营养液的方式解决白及原球茎对营养消耗的补充。该试验对白及种子在液体条件下无菌萌发进行研究，能够形成健壮一致的原球茎，为快速生产白及无菌苗提供有效的技术参数，为推动白及种苗规模化生产奠定坚实基础。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志：第18卷[M]．北京:科学出版社，1999．

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[3] 韩学俭.白芨药用及其栽培技术[J].农村经济与科技，2004(10):31-32．

[4] 陆善旦.白及种植技术[J].农村新技术，2008(19):4-5．

[5] 李伟平,何良艳,丁志山.白芨的应用及资源现状[J]．中华中医药学刊, 2012, 30(1):158．

[6] 汪计珠，丁家宜，边可庚.白及的组织培养[J].植物生理学通讯,1982(2):37.

[7] 田翠英,袁雄强.白及组织培养快繁技术研究[J].江苏农业科学,2006(6):75-77.

[8] 彭丽丽,刘祥东,刘华，等.白芨的组培快繁(简报)[J].中国野生植物资源,2004，23(5):65.

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[10] 张建霞,付志惠,李洪林，等.白芨胚发育与种子萌发的关系[J].亚热带植物科学,2005,34(4):32-35.

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[12] 郭顺星,徐锦堂.白芨种子萌发和幼苗生长与紫萁小菇等4种真菌的关系[J].中国医学科学院学报,1992,14(1):51-54.

Fluid Suspension Culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. Protocorm

TANG Xing-li1,2, LI Lin-hua3, ZHOU Yi-feng2,4et al

(1. Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095; 2. Dongtai Institute of Tidal Flats, Nanjing Branch of Chinese Academy of Sciences, Yancheng, Jiangsu 224200; 3. Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wuhu, Anhui 241003; 4. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014)

[Objective] To research the optimum germination condition for liquid suspension culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. seeds, and to provide technological supports for the rapid propagation ofB.striataseedlings and saving its resources. [Method] The effects of different light conditions, culture mediums and the hormone types and concentrations on the germination ofB.striataseeds were investigated. [Result] Dark culture was beneficial to the germination ofB.striataseeds, and the medium of 1/2 MS was a proper basic medium for the seed germination. In addition, plant hormones could promote the seeds germination, among them, adding 1.0 mg/L NAA in the medium was the most effective. [Conclusion] Under dark culture, with 1/2 MS+1.0 mg/L NAA as a germination medium, theB.striataseeds have a high germination rate and orderly germination, and the protocorm has a consistent growth rate.

Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.; Liquid suspension culture; Protocorm

江苏省产学研联合创新资金前瞻性研究项目(BY2014116)。

汤兴利(1974- )，女，湖北浠水人，讲师，硕士，从事药用植物资源开发利用研究。

2016-08-29

S 188

A

0517-6611(2016)29-0151-03