响应面设计优化苎麻叶黄酮提取工艺

王宗成，彭延波，盘雪，宋高银，刘燚琳，周勇，王希

（1.湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州425199；2.湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陕西西安710075；4.株洲市食品药品检验所，湖南株洲412000）

响应面设计优化苎麻叶黄酮提取工艺

王宗成1，2，彭延波1，盘雪1，宋高银1，刘燚琳1，周勇3，王希4*

（1.湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州425199；2.湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陕西西安710075；4.株洲市食品药品检验所，湖南株洲412000）

为优化苎麻叶黄酮提取工艺，分别对料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间和提取次数进行单因素试验。在单因素的基础上，以提取率为响应值，进行了经典的Box-Benhnken三因素三水平响应面设计优化。得到最佳工艺条件为料液比1∶43，乙醇体积分数70%，提取温度80℃，每次提取时间90 min，提取两次。试验结论为提高苎麻叶黄酮利用率及其工业化生产提供了一定的理论参考。

响应面分析法；苎麻叶；黄酮提取

苎麻原产于我国，为荨麻科苎麻属多年生草本植物。苎麻是一种重要的纤维性经济作物，是我国重要的出口创汇经济作物，国际上称“中国草”（贺波等，2010）。苎麻目前主要用于纺织工业原料，而苎麻叶作为工业废弃品丢弃，资源浪费严重并污染环境。现代药学研究结果表明，苎麻叶具有丰富的药用和保健价值（肖呈祥，2014；熊维新等，2006）。苎麻叶中含有绿原酸、原儿茶酸等有机酸和野漆树苷、芸香苷等黄酮苷（施树云，2004；赵立宁等，2003）。试验以永州野生风干苎麻叶为原料，应用响应面分析法优化苎麻叶中黄酮的回流提取工艺，为进一步开发苎麻叶资源提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器试验原材料为苎麻叶，2015年 7月下旬采摘于湖南科技学院旁西山，经鉴定为野生苎麻品种，挑选新鲜干净苎麻叶，采摘后，经清洗，烘干，室温保存于实验室备用。芦丁标准品、实验用石油醚、纯度为95%的乙醇、亚硝酸钠、九水硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯。

T6可见分光光度计、TE124S电子天平、RE-52B旋转蒸发仪、比色管、烘箱、烧杯、容量瓶、移液管、移液枪、胶头滴管、玻璃棒、量筒、回流提取装置等。

1.2黄酮含量测定的标准溶液及标准曲线的绘制标准溶液的配制为0.2 mg/mL的芦丁标准液。分别取0、1、2、3、4、5、6 mL的0.2 mg/mL芦丁标准溶液于7个25 mL容量瓶中，先用移液枪分别加入0.6 mL 5%的亚硝酸钠，放置6 min，然后加0.6 mL 10%的硝酸铝后放置6 min，最后加1.0 mol/L的NaOH 8.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置12 min得测定液，以空白溶液作参比，在λ= 510 nm处测吸光度，计算标准液浓度（C）与吸光度（A）的回归方程A=kC+b（黄瓒，2012）。得回归方程为：

式中，C代表芦丁溶液的质量浓度，A代表510 nm处的吸光度。曲线在0～0.06 mg/mL质量浓度范围有良好的线性关系。

1.3苎麻叶中黄酮化合物的提取及其计算按照标准曲线绘制方法，测定吸光度，根据标准曲线计算出测定样品溶液总黄酮浓度C。然后计算样品中总黄酮的提取率。

式中：C为测定样品溶液总黄酮浓度，mg/mL；N为稀释倍数，数值为100；V为最初样品定容体积，mL，数值为50；m为样品质量，g，数值为5。

1.4单因素试验考察料液比、提取次数、乙醇体积分数、提取温度和提取时间五个影响因素对苎麻叶提取率的影响。

1.5响应面设计试验在单因素试验的基础上选取3个对乙醇提取黄酮影响比较显著的因素：料液比、乙醇体积分数、提取温度，在固定提取时间90 min、提取次数2次的条件下采用经典的三因素三水平试验设计进行响应面试验确定苎麻叶中黄酮提取的最佳工艺（王宗成，2015）。因素与水平见表1。

表1　苎麻叶黄酮提取工艺条件的Box-Behnken中心组合设计试验因素与水平

2　结果与讨论

2.1单因素试验结果及分析

2.1.1料液比对提取率的影响取样品5 g，乙醇体积分数70%，恒温80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究料液比对黄酮提取率的影响，结果如图1所示。在其他条件不变的情况下，提取率随料液比增大而增大，当料液比为1∶40时提取率接近最大值，之后逐步下降。所以最适料液比为1∶40。

图1　料液比对提取率的影响

2.1.2提取次数对提取率的影响取样品5 g，体积分数为70%的乙醇，料液比1∶40，恒温80℃，按每次90 min回流提取，研究提取次数对黄铜提取率的影响，结果如图2所示。提取次数为2次时，黄酮提取率接近最大值，提取3次较提取2次来说差别不大，考虑到生产成本，故应以提取2次为宜。

图2　提取次数对提取率的影响

2.1.3乙醇体积分数对提取率的影响取样品5 g，料液比1∶40，恒温80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究乙醇体积分数对黄酮提取率的影响，结果如图3所示。在其他条件不变的情况下，提取率随着乙醇体积分数增大而增大，但是超过70%时提取率逐渐下降，因此认为70%乙醇为宜。

图3　乙醇体积分数对提取率的影响

2.1.4提取温度对提取率的影响取样品5 g，70%的乙醇，1∶40的料液比，回流提取2次，每次提取90 min，考察温度高低对黄酮提取率的影响，结果如图4所示。在其他条件不变的情况下，提取温度对提取率有一定影响，提取温度应以80℃为宜。

图4　提取温度对提取率的影响

2.1.5提取时间对提取率的影响取5 g样品，70%的乙醇，料液比1∶40，恒温80℃，分别在每次提取30、60、90、120 min的条件下回流提取2次，考察提取时间对苎麻叶总黄酮提取率的影响。图5显示提取时间对苎麻叶总黄酮提取率影响较大，随时间延长提取率逐渐增大，提取时间达90 min以后提取率反而减少，可以看出对苎麻叶的最佳提取时间为90 min。

图5　提取时间对提取率的影响

2.2响应面设计试验结果及分析

2.2.1响应曲面分析与优化由响应面图6～8可以看出，响应面图各试验因素的最佳参数及各试验因素之间的相互作用。由苎麻叶黄酮提取率（Y）对料液比（A）、提取温度（B）、乙醇浓度（C）各试验因素所构成的响应曲面图可以直观地看出交互作用对苎麻叶黄酮提取率的影响，试验设计及试验结果见表2。

图6　料液比与乙醇浓度对黄酮提取率的交互作用

图7　提取温度与乙醇浓度对黄酮提取率的交互作用

图8　料液比与提取温度对黄酮提取率的交互作用

表2　苎麻叶总黄酮提取工艺条件的响应面法试验优化及结果

2.2.2回归模型的方差分析从表3可以看出，模型的F=116.22、P＜0.0001，说明本试验所采用的二次模型是很显著的。PA、PB、PC、PAC、PBC、PA2、PB2、PC2均小于0.05，说明料液比、提取温度、乙醇浓度、料液比和乙醇浓度的交互项、提取温度与乙醇浓度的交互项以及3个因素的二次项都具有显著影响；而其他交互项显著性较差，也说明料液比与提取温度的交互作用不大。决定因素R2= 0.9934，说明模型能够很好地反映响应值的变化，拟合度好。各因素的效应关系为：A（料液比）＞C（乙醇浓度）＞B（提取温度）。

2.2.3提取条件的优化用Design-expert 8.0.5.0软件选择逐步回归方法对二次多项式回归方程做进一步优化，最佳的提取条件为乙醇体积分数70.47%、料液比1∶43.08、提取温度80.41℃，预测提取率为37.69 mg/g。但考虑到实际操作的可行性与便利性，将其参数修正如下：乙醇体积分数为70%、料液比为1∶43、提取温度为80℃。

表3　苎麻叶黄酮提取工艺条件响应曲面回归方程的方差分析

3　结论

本试验通过响应面法设计优化乙醇回流提取苎麻叶黄酮的工艺，采用Box-Behnken设计方案建立的二次多项数学模型能较准确地预测苎麻叶黄酮的提取率。通过响应曲面综合分析得出了该试验的最优方案为：乙醇体积分数为70%，料液比为1∶43，提取温度为80℃。本试验所得到的工艺条件，可行性强，重复性好，为其工业化扩大生产和苎麻叶资源进一步开发利用提供理论基础。

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[2]黄瓒，李振申，王宗成.楮树叶总黄酮提取工艺优化[J].湖南科技学院学报，2012，33（8）：30～34.

[3]施树云.苎麻叶和红豆杉中活性成分的提取、纯化及测定研究[硕士学位论文][D].湖南长沙：中南大学，2004.

[4]王宗成，蒋玉仁，刘小文，等.响应面优化生姜茎叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发，2015，27（9）：1582～1588.

[5]肖呈祥.苎麻总黄酮的基因型差异及黄酮分离与检测工艺优化研究[硕士学位论文][D].湖南长沙：湖南农业大学，2014.

[6]熊维新，李开泉.苎麻的药用开发价值[J].江西中医药大学学报，2006，18（3）：51～52.

[7]赵立宁，臧巩固，李育君，等.苎麻（Boehmeria）绿原酸和黄酮含量测定[J].中国麻业，2003，25（2）：62～64.■

For the optimization of ramie leaves flavonoids extraction process，through the single factor experiment，the material liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction temperature，extraction time and times of extraction were analysed.Based on single-factor tests，Box-Benhnken three factors three levels experiment by response surface design was carried out.The results showed that optimum conditions for 1∶43 solid to liquid ratio，70%ethanol，temperature of 80℃，extraction time of 90 min，extraction two times.These results provided a theoretical reference for improving the utilization ratio of flavonoids from the ramie leaves and its industrial production.

response surface method；ramie leaf；flavonoids extraction

S816.7

A

1004-3314（2016）19-0012-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161903

湖南省高校科技创新团队支持计划资助（2012-318）；湖南省教育厅资助科研项目（15C0587）