一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定

项聪英 蔡年俊 李静 羊健 陈剑平,* 张恒木,*

(1浙江师范大学 化学与生命科学学院， 浙江 金华 321004； 2 浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所， 杭州310021；*通讯联系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)



一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定

项聪英1, 2蔡年俊1, 2李静2羊健2陈剑平2,*张恒木2,*

(1浙江师范大学 化学与生命科学学院， 浙江 金华 321004；2浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所， 杭州310021；*通讯联系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

XIANG Congying, CAI Nianjun, LI Jing, et al. Cloning and characterization of a small heat shock protein (SHSP) gene in rice plant. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 587-592.

小分子热休克蛋白(SHSP)广泛存在于各类生物体中且在生物发育和逆境响应过程中发挥重要作用。我们克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6)，序列分析表明该基因编码区为477 bp，可编码一个含158 个氨基酸的多肽，分子量约17.6 kD。序列分析显示该类SHSP在不同的植物中是保守的，在分类上隶属于CI类。实时定量RT-PCR分析显示热激处理可显著增强该基因的转录；Western blotting分析显示该蛋白大小与预期一致，且其含量在热激处理时大幅度增加。这些结果一致表明OsSHSP17.6可能参与了水稻热应激反应，这为进一步鉴定OsSHSP17.6的功能提供了基础。

小热休克蛋白； 热激处理； 表达模式

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)被认为是一类高度进化、结构保守的分子伴侣蛋白[1-2]，因其在高温胁迫下被高水平诱导表达而得名。实际上，植物热休克蛋白基因的表达受很多生物或非生物逆境的影响，除了受热刺激诱导，还会受低温、干旱、盐碱以及重氮化合物、2，4-二硝基苯酚、水杨酸盐等化学物质的影响[2]，同时还受到病毒、细菌、真菌等多种病原侵染的诱导[3-4]。

热休克蛋白广泛存在于各类细胞中，其分子量为10 kD～200 kD，其中小热休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)是一类分子量在15～30kD之间的蛋白[1]。SHSP是植物体内最为丰富的一类热休克蛋白，被认为是植物抗逆过程中的第一条防线[5]，保护细胞免受诸多环境胁迫，如重金属、干旱、冷冻、氧化胁迫等。最近也有少数报道显示，SHSP参与生物逆境响应过程[4,6]。据统计，哺乳动物中含有4个SHSP，果蝇中有4个SHSP，细菌中有2个SHSP，而拟南芥中有19个[7]，很显然，相比之下，植物SHSP明显具有更为复杂的多样性。根据进化树分析，植物SHSP至少被分为14个亚类(subfamilies)，亚细胞定位预测显示，这些SHSP可能定位于不同的细胞器，包括细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体、内质网、过氧化物体[8]。SHSP在不同细胞器中定位至少在一定程度上反应了植物SHSP的功能差异和功能多样性，但对于它们的功能特点至今仍然了解很少。本实验室在研究水稻条纹病毒与水稻基因互作的过程中首次发现了植物病毒侵染可改变SHSP在细胞内的定位和分布模式[4]，进一步分析显示水稻条纹病毒复制酶可特异性地与宿主水稻一个SHSP在细胞质中相互作用，表明植物SHSP参与了病毒与宿主之间的互作过程。为了进一步探索该基因的功能特性，本研究从日本晴水稻中克隆鉴定了该基因，并进一步通过qRT-PCR和Western blotting技术分析了其在热激条件下的表达特点。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻品种为日本晴。大肠杆菌(Eschrichiacoli)菌株DH5α购于北京全式金生物有限公司；pGEM-T Easy载体购自Promega公司；SDS-PAGE低分子量蛋白标准购自Invitrogen公司；T4DNA连接酶、BamHⅠ和NdeⅠ购自TaKaRa公司；高纯度质粒小提试剂盒购自康为世纪公司；反转录所用的第一链 cDNA 合成试剂盒购自TOYOBO公司；荧光定量PCR所用的SYBR Green I PCR 试剂盒购自Invitrogen公司；引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

1.2 水稻培养及其总RNA、总蛋白质提取

日本晴水稻幼苗在光照培养箱培养，培养条件为(26±2)℃，16 h光照/8 h黑暗，培养3周后在设定温度下热激2 h。热激处理后，分别采集对照和处理的水稻叶片，用Trizol试剂(Invitrogen)参照商家说明提取水稻叶片总RNA；参照羊健等[9]方法提取植物总蛋白。

1.3 水稻cDNA合成

取1 μg总RNA作模板，以Oligo(dT)18作为逆转引物，采用第一链cDNA 合成试剂盒(TOYOBO)参照商家说明配制好反应体系，反应总体积20 μL，然后在42℃条件下孵育2 h，合成好的cDNA，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4 OsSHSP17.6基因扩增和克隆

根据数据库中Os03G026700(编码OsSHSP17.6的序列号)获得的序列，使用DNAMAN软件设计了一对引物，即pF1(5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′)和pR1(5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)。取上述cDNA 1 μL作为基因扩增的模板，分别取浓度为20 μmol/L的引物pF1和pR1各0.3 μL，其他按照PCR试剂盒说明配制总体积为25 μL的反应体系。先94℃下预变性3 min；然后94℃下 30 s， 60℃下 30 s，72℃下 1 min的条件下反应30个循环；最后72℃下延伸10 min，即获得PCR扩增产物。

1.5 基因克隆和测序

扩增产物经2% 琼脂糖凝胶电泳分离后，应用PCR产物切胶纯化试剂盒(Promega公司)切胶回收预期大小的片段，回收纯化的具体步骤参照商家说明。纯化的产物连接至pGEM-T-Easy载体(Promega公司)，然后转化大肠杆菌DH5α并涂于氨苄抗性的LB平板，37℃下培养16 h后，选取若干菌落进行菌落PCR和双酶切验证，将含预期大小插入片段的克隆送至杭州博尚公司进行测序。

1.6 序列分析

测序结果经DNAMAN Version 6软件(Lynnon公司)组装后，与NCBI数据库中的序列比对。采用NCBI中保守结构域数据库(Conserved Domain Database，CDD，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行蛋白质结构域分析。采用MEGA6[10]中Neighbor-Joining算法构建进化树，其中bootstrap值设置为1000。利用swiss-model 分子建模服务系统(http://www.swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质三维结构预测[11]，并采用rasmol软件(http://www.openRasmol.org)对模型结构进行分析。

1.7 实时定量PCR(real time Quantitative PCR，qRT-PCR)

根据测定的OsSHSP17.6基因序列，使用DNAMAN软件设计了2对引物(pQF，5′-AAG TTC CTC CGC AGG TTC C-3′；pQR，5′-GAG CAC GCC GTT CTC CAT-3′)用于qPCR分析。每个qPCR含有10 μL 2×SYBR PCR master mix(购自TOYOBO公司)、10 μmol/L浓度的引物pQF和pQR各0.8 μL 、 0.5 μL cDNA，然后加ddH2O至20 μL， 反应置于Applied Biosystems公司7900定量PCR仪上进行，反应条件为95℃下先预变性3 min，接着95℃下15 s，60℃下20 s，72℃下30 s，循环40次；然后样品从60℃加热至95℃获得扩增产物的熔解曲线。每个反应至少3个重复，以Actin基因作为内参[12]，通过2-ΔΔCT方法计算相对表达量[13]。

1.8 蛋白质印迹分析

总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，通过电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，用OsSHSP17.6兔抗作为一抗，参照梁国栋[14]的方法进行蛋白质印迹分析，用eECL Western Blot Kit显色。

2 结果与讨论

2.1 基因克隆及序列分析

为了克隆该水稻基因，设计了1对引物(pF1：5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′和pR1：5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)以水稻总cDNA为模板进行了扩增，扩增产物长度约500 bp，与预期结果一致；回收纯化扩增的预期片段并将其连接至pGEM-T Easy载体，然后转化大肠杆菌经菌落PCR鉴定后利用通用引物T7、SP6进行双向测序。测序结果表明，该基因的编码区长度为477 bp，可编码一个含158 个氨基酸的多肽，分子量约17.6 kD。

登录号分别为：SiSHSP(XP004984667，谷子)、AtSHSP(EMT09347，粗山羊草)、BdSHSP(XP010228221，二穗短柄草)、ZmSHSP(ACG35098，玉米)、SbSHSP(KXG39718，高粱)。

Accession numbers: SiSHSP (XP004984667,Setariaitalica), AtSHSP (EMT09347,Aegilopstauschii), BdSHSP (XP010228221,Brachypodiumdistachyon), ZmSHSP (ACG35098,Zeamays), SbSHSP (KXG39718，Sorghumbicolor).

图1 OsSHSP17.6序列同源性(A)及保守结构域(B)分析

Fig. 1. Sequence homology (A) and conserved domain (B) analyses of OsSHSP17.6.

利用BLASTp程序搜索NCBI数据库，显示该类蛋白在其他植物中也存在高度同源的类似蛋白，序列比对分析显示其序列同源性高达84.28%～89.94%(图1-A)，表示该蛋白在植物中是保守的。二级结构分析显示该类蛋白至少含有2个α螺旋，10个β折叠；蛋白保守结构域分析显示该蛋白近C-端区域(aa52-143)存在一个保守的个α-晶体蛋白结构域(α-crystallin domain，ACD)(图1-B)，该结构域包含92个氨基酸残基序列，类似的结构多存在于小热休克蛋白(small heat shock proteins，SHSP)及其他具有分子伴侣的蛋白中[15]，表明该基因可能编码一个水稻小热休克蛋白，暂命名为OsSHSP17.6。

目前拟南芥SHSP研究得较多，分类已经明确[8]。为了确定本研究所克隆的热休克蛋白OsSHSP17.6所属类型，我们从数据库中下载了拟南芥SHSP序列[8]，采用MEGA6软件进行进化树分析(图2)， OsSHSP17.6恰好与拟南芥CI类SHSP位于一簇，表明本研究克隆的OsSHSP17.6应归属于CI类SHSP。

2.2 热激对OsSHSP17.6转录水平的影响

前面的分析表明OsSHSP17.6是一个热休克蛋白。为了检测OsSHSP17.6的表达是否受高温影响，我们将在(26±2)℃条件下培养3周的水稻苗分为2组，一组为对照组，继续在(26±2)℃条件下培养；另一组为处理组，在(45±2)℃条件(其他条件不变)下热激培养2 h，随后提取2组水稻总RNA进行逆转录获得cDNA，再利用实时定量PCR技术分析OsSHSP17.6转录水平的变化(图3)。相对于(26±2)℃的条件，(45±2)℃的温度条件使得OsSHSP17.6基因在转录水平上增加了约74倍，表明OsSHSP17.6基因具有热激转录活性。

图2 OsSHSP17.6与拟南芥中的小热休克蛋白进化关系

Fig. 2. Phylogenetic relationship of OsSHSP17.6 with SHSPs from Arabidopsis thaliana.

图3 实时定量PCR分析OsSHSP17.6基因转录水平

Fig. 3. Transcription level of OsSHSP17.6 by real-time quantitative PCR.

2.3 热激对OsSHSP17.6蛋白质翻译水平的影响

为了确定热激后OsSHSP17.6在蛋白水平上的变化，我们又提取了上述对照组和热激处理组的水稻总蛋白，并利用OsSHSP17.6兔抗进行Western blotting分析(图4)。在热激处理的水稻中可特异性地在17.6 kD处检测到一条显色较强的条带，且分子量与OsSHSP17.6的预期大小一致；而对照组中在17.6 kD处则未检测到相应的条带，表明了该蛋白在翻译水平也是显著增加的，也表明热激有利于OsSHSP17.6的积累，这与该基因转录水平在热激处理时增强的结果一致；另一方面，我们还发现在约80 kD处也检测到显色较强的条带，而且在对照和热激处理样品中均检测到该条带，但很显然热激处理样品中该条带更强，相比之下，对照样品中该条带则弱得多，表明该条带蛋白也是热诱导蛋白。从该条带的特异性推测该条带可能是OsSHSP17.6蛋白的寡聚体，已有报道显示小热休克蛋白通常作为分子伴侣蛋白在胁迫响应过程中起作用[1,2]，而且小热休克蛋白在植物体内和SDS-PAGE时均可以寡聚体的形式存在[4,16,17]；该条带蛋白的水平与OsSHSP17.6基因转录水平在热激条件下都显著提高，这种相关性看上去支持该蛋白是OsSHSP17.6蛋白的寡聚体形式。但由于在17.6 kD处未检测到相应的条带，尚不能排除该大分子量蛋白条带是一种与OsSHSP17.6同源蛋白的可能性，因此，该大分子量蛋白尚待进一步鉴定以明确其本质。

M-蛋白标记; 第1泳道为对照组样品; 第2泳道为热激处理样品。

M, Protein marker; Lane 1, Control sample; Lane 2, Sample treated with heat shock.

图4 Western blot分析OsSHSP17.6蛋白的表达水平

Fig. 4. Translational level of OsSHSP17.6 by Western blotting.

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Cloning and Characterization of a Small Heat Shock Protein (SHSP) Gene in Rice Plant

XIANG Cong-ying1, 2, CAI Nian-jun1, 2, LI Jing2, YANG Jian2, CHEN Jian-ping2, *, ZHANG Heng-mu2, *

(1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory of Biotechnology in Plant Protection of MOA and Zhejiang Province, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;*Corresponding author, E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

Small heat shock proteins (SHSPs) exist widely in all kinds of creatures and play an important role in both development and stress responses. A gene encoding a SHSP (OsSHSP17.6) was cloned fromOryzasativaand the sequence assembly showed the encoding region of OsSHSP17.6 was 477 bp in length, encoding a polypeptide of 158 aa with a molecular weight of 17.6 kD. Sequence analysis showed that such kind of SHSPs was conserved in different plants and belonged to the cytosolic class I (CI). The transcriptional level of OsSHSP17.6 was significantly up-regulated by heat shock with qRT-PCR. The protein appeared to be accumulated up to higher level under the condition of heat shock in western blotting assays. Taken together, these findings consistently indicated that OsSHPS17.6 could be involved into the response to heat shock, which could contribute to understanding the function of OsSHSP17.6.

small heat shock protein (SHSP)； heat shock； expression pattern

2016-03-30； 修改稿收到日期: 2016-04-29。

浙江省自然科学基金资助项目(LQ14-C140003)。

Q785; S511.01

A

1001-7216(2016)06-0587-06

项聪英, 蔡年俊, 李静, 等. 一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定. 中国水稻科学， 2016， 30(6)： 587-592.