7种甘肃道地药材凝血活性初步分析

袁毅君，赵　丽，焦成瑾，陈　荃

（天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001）

7种甘肃道地药材凝血活性初步分析

袁毅君，赵丽，焦成瑾，陈荃

（天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001）

目的：检测7种甘肃道地药材对鸡、兔红细胞的凝集活性。方法：将7种药材分别用PBS（磷酸缓冲液）浸提，浸提液分别对兔和鸡红细胞进行凝集活性测定，以检测7种药材的最低效价。结果：7种中药浸提液对红细胞表现不同的凝集活性，具有较高凝集活性的为防风对兔红细胞效价23；大黄对鸡红细胞效价25.结论：7种中药均有不同的凝集活性，同种中药对不同红细胞的凝集活性不同。

道地药材；凝血活性；凝集素；效价

凝集素是一类糖结合专一性的非免疫来源的能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白，普遍分布于微生物、植物与动物中的细胞凝集因子，具有凝集红细胞的作用。[1-3]凝集素广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等众多植物类群以及菌类中。已发现的植物凝集素近千种，其中以豆科植物最多，豆科植物凝集素有600多种。近年来通过分离鉴定，对它们的性质、分子结构及功能做了大量研究，许多工作已深入到基因水平。对植物凝集素的研究主要集中在生物学、医学、农学等方面，在血型鉴定，调节免疫机能，骨髓移植，促进有丝分裂作用，抑制肿瘤生长，抗病毒，诊断与鉴别诊断，参与人类很多疾病过程以及在植物病虫害防治，生物固氮等方面都有研究和应用。[4-7]另外，凝集素已经成为某些疾病的预警分子，如在肿瘤的发生发展进程中与肿瘤细胞的侵袭能力相关，在肿瘤组织中都有异常表达，即可作为多种恶性肿瘤和癌前病变的早期检测标志物，也可作为肿瘤预后评价的参考指标。[8-9]因此凝集素的生化特性和生物学功能已经成为研究的热点。

甘肃省为我国中草药重要产地之一，出口量占90%.本区盛产黄芪、红芪、纹党、岷当、大黄等药材。[10,11]药理研究证明来自道地药材黄芪、红芪、党参、当归的多糖具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、抗炎等多种作用。[12-14]黄芪的不同提取物包括黄芪总提取物、黄芪多糖或黄芪皂甙以及红芪多糖，抑制肿瘤细胞生长的作用。[15-17]有关甘肃道地药材凝集素凝集活性的初步研究方面少见报道。[18-19]本项工作收集产于甘肃本地的7种中药材，作用于两种红细胞对其凝集活性进行初步测定，旨在为道地药材的药理活性的研究提供相关资料。

1　材料与方法

1.1中药材

7种药材均采购于产地，见表1.为未炮制处理的原药材，粉碎过筛，冷藏备用。

表1　7种药材产地

1.2主要试剂与仪器

所用试剂均为AR级，包括：PBS缓冲液（氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾）、阿氏液（柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、葡萄糖）等。

Olympus倒置显微镜及其显微摄像系统（JA⁃PAN）；电子恒温干燥箱（型号：GZX-DH-40X45-13S，上海跃进医疗器械厂）；高速台式冷冻离心机（型号：TGL-20M，长沙湘仪离心机有限公司）；电子天平（型号：SHIMADZU AUY220）；数控超声波清洗仪（型号：KQ-50DB，昆山市超声波仪器有限公司）等。

1.3阿氏液、PBS缓冲液的制备[20]

阿氏液：称取葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.88g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，蒸馏水溶解定容至100ml，置4℃冰箱保存备用。

PBS缓冲液：称取氯化钠1.44g、磷酸二氢钠0.296g、磷酸氢二钾0.086g，蒸馏水溶解定容至200ml，置4℃冰箱保存备用。

1.42%红细胞悬液制备[7，19，21]

使用吸有肝素的注射器自兔耳缘静脉抽取血液或鸡自翼下静脉抽取血液。将新鲜血液以阿氏液5倍体积稀释混匀，4℃冰箱保存。临用时0.85%生理盐水离心洗涤4次（1500r/min，5min）。弃上清液和界面白细胞层，至细胞压积值恒定。用阿氏液配成压积比为2%的红细胞悬液。

1.5中药材浸提液的制备[22]

分别称取7种中药材粉末各2g，于烧杯中各加入20ml的PBS缓冲液，充分搅拌后，放置4℃冰箱浸泡24h.用尼龙布将各种中药材浸提液过滤，滤液离心，10000r/min，10min，4℃.离心后转移上清，4℃冰箱保存待用。

1.6凝集现象观察与效价测定[22]

取双凹载片，做好标记，设PBS为空白对照。用微量移液枪在第一张载片加入中药材浸提液25μl，并依次倍比稀释，平行样3个，最后加入兔红细胞悬液（rabbit Red Blood Cell，rRBC）25μl，混匀后静置20～30min，肉眼和显微镜观察红细胞凝集现象并确定凝集效价。通过Olympus数码摄像系统选取典型凝集现象玻片进行显微拍照。

用同样方法进行鸡红细胞（chicken Red Blood Cell，cRBC）凝集现象观察与凝集效价评定。

2　结　果

2.17种中药的凝血现象

结果见图1.图1中A与B图为PBS对照，从图1中的A与B图显示细胞之间比较松散，呈单个分散状，并且细胞保持着原有的形态，分别以7种道地药材浸提液处理鸡红细胞（chicken Red Blood Cell，cRBC）与兔红细胞（rabbit Red Blood Cell， rRBC）后，观察凝集反应发现，板蓝根、大黄、当归、党参、防风、甘草、黄芪有明显的凝集现象出现，不同的中药凝集效果不同，具体结果见图1 C-P图。凝集反应发生时，凝集的红细胞呈片状，如板蓝根和甘草的浸提液作用于cRBC或rRBC后呈现的凝集现象；还有凝集红细胞成团块，如防风的浸提液作用于cRBC或rRBC后的凝集现象；或凝集红细胞成串珠状，如大黄浸提液作用于cRBC或rRBC后的凝集现象；或凝集红细胞状态介于上述现象之间，如当归、党参、黄芪。图1 D、K图显示rRBC或cRBC的形态出现了轻微变形。由于中草药中所含成分复杂，因而浸提液对细胞形态产生影响。

图1　7种道地药材对鸡红细胞和兔红细胞的凝集效应

2.27种中药浸提液凝集效价测定结果[18]

中药材中提取的凝集素生物活性的大小通常用凝集效价来表示，即能引起凝集现象的凝集素的最高稀释倍数2n表示(n为中药材待测样品所含凝集素的稀释倍数，稀释倍数越高其生物活性就越高)，实验中的7种道地药材的凝集素活性见表2.

由表2可见，所检测的7种药材分属5科，使cRBC凝集的效价最高为大黄32（25），最低为甘草2（21）；使rRBC凝集的效价最高为防风8（23），最低为甘草2（21）。将药材中提取的凝集素的凝集效价分为四级（见表2），一级效价为>128；二级效价为32～64；三级效价为8～16；四级效价<8.则cRBC凝集效价：二级计1种为大黄；三级计5种为板蓝根、当归、党参、防风、黄芪；四级计1种为甘草。rRBC凝集效价：三级效价计1种是防风；四级效价计6种分别为板蓝根、大黄、当归、党参、甘草、黄芪。

表2　7种中药浸提液凝集效价

3　讨　论

所检测的7种产于甘肃的道地药材，以PBS制备的浸提液对兔红细胞和鸡红细胞均显示出凝集活性，但凝集效价在不同的红细胞不同。同时表明PBS适合提取所采集的7种道地药材中的凝集素。被测7种中药的浸提液提取后对红细胞表现不同的凝集活性，防风对兔红细胞具有较高凝集活性：23；大黄对鸡红细胞：25.并且同一种中药对不同血细胞的凝集活性也存在明显差异。7种中药材中如当归、防风同属于伞形科，甘草、黄芪同属于豆科，但各自的凝集效应存在明显差异，与其凝集素的含量不同或其所含有的凝集素种类、性质不同有关。

植物凝集素与细胞表面糖分子结合，导致细胞与分子间、细胞与细胞间的信号识别；引发细胞内一系列生化反应，如诱导细胞凋亡和自噬。[2]转移程度高的肿瘤细胞高水平表达凝集素，参与同相邻肿瘤细胞或寄主细胞的识别与粘附。[9]半夏凝集素在0.5或l mg/mL时抑制Hela细胞增殖；[23]骆驼蓬凝集素显著抑制Hela细胞增殖并诱导凋亡发生，对人类食管癌细胞(Eca-109)和人类肝癌细胞(BEL-7404)也有抗增殖活性。[24]蒙古黄芪凝集素(AMML)通过S期阻滞抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡。表明AMML是一个有效的细胞周期阻滞剂和细胞凋亡诱导剂，为其在肿瘤防治中的应用提供重要的依据。[25]板蓝根凝集素具有促进胸腺淋巴细胞分裂的能力，提高机体免疫能力，显著预防与良好治疗流感病毒。仅马蓝板蓝根凝集素具有血凝活性。抑毒试验证明板蓝根凝集素的效价与其抑制流感病毒的作用成正相关，凝集活性不同最主要在种属差异与地域差异。[19,26,27]植物凝集素有明显的增强免疫、抗肿瘤和杀伤癌细胞的活性，未来可作为抗肿瘤药物进行开发并应用于临床。

显然甘肃道地药材凝集素方面的研究还处于起步阶段，有关凝集素的分离、纯化与单体获得，其分子结构解析与道地药材来源的凝集素多种药理活性仍需进一步的研究开发。凝集素的生物活性研究将对道地药材多种药理活性的阐明也有重要意义。

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〔责任编辑王小风〕

The Preliminary Analysis of Agglutinating Activity of Seven Kinds of Genuine Medicinal Materials in Gansu

Yuan Yijun1,Jiao ChengJin,Chen Quan,Zhao Li
(College of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui Gansu741001,China)

Objective:To test the agglutinating activity about seven kinds of Genuine Medicinal Materials in Gansu react with the red blood cells of chicken and rabbit respectively.Methods:Selected seven medicinal herbs were ex⁃tracted with PBS,then extracts agglutinating activity were detected with the red blood cells from rabbit and chicken respectively,determined the lowest titer of the herbs.Results:The agglutination activities of the lectins varied in the seven herbs extracts,and the higher agglutinating activity of the herb lectins in the two different blood cells are fol⁃lows:the titer of extracts from Radix Saposhnikoviae with the rabbit red blood cells is 23;but the titer of extracts from Radix et Rhizoma Rhel with chicken red blood cells is 25.Conclusion:Seven kinds of Chinese herbs present better agglutinating activity,the same Chinese herbs has different agglutinating activity with different erythrocyte samples.

Genuine Medicinal Materials;agglutinating activity;lectin;titer

R932

A

1671-1351（2016）05-0015-04

2016-06-11

袁毅君（1966-），女，甘肃天水人，天水师范学院生物工程与技术学院教授，博士。

国家自然基金项目“基于抑制硫氧还蛋白还原酶活性的甘肃道地药材抗癌成分筛选”（81360619）阶段性成果