益生菌对新城疫疫苗免疫雏鸡免疫器官T细胞增殖能力和IL-2 mRNA表达影响

白 玉 ， 李 琰 ， 高雪丽 ， 刘超男 ， 吕晓萍 ， 郑世民

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030 ； 2. 四川省畜牧科学研究院， 四川成都610066)

益生菌对新城疫疫苗免疫雏鸡免疫器官T细胞增殖能力和IL-2 mRNA表达影响

白 玉1， 李 琰2， 高雪丽1， 刘超男1， 吕晓萍1， 郑世民1

(1.东北农业大学动物医学学院， 黑龙江哈尔滨150030 ； 2. 四川省畜牧科学研究院， 四川成都610066)

为探索益生菌对新城疫(ND)疫苗免疫雏鸡的免疫效果影响。 将100只1日龄AA肉鸡随机分为益生菌组、 ND疫苗单独免疫组、 益生菌联合ND疫苗应用组和空白对照组。 采用MTT法和实时荧光定量PCR法检测各试验雏鸡于ND疫苗两次应用后0、 7、 14、 28、 42 d胸腺、 脾脏中细胞免疫功能及IL-2 mRNA的表达。 结果发现， 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后， 其胸腺和脾脏中T细胞增殖能力和IL-2 mRNA表达， 分别于ND疫苗免疫后7～28 d明显(P<0.05或P<0.01)高于ND疫苗或益生菌单独应用雏鸡。 表明益生菌可通过提高雏鸡免疫器官中T细胞增殖功能和IL-2 mRNA表达， 发挥增强ND疫苗免疫效应作用。

益生菌 ； 新城疫疫苗 ； T细胞增殖能力 ； 白细胞介素-2 mRNA表达

益生菌是活的，有助于机体肠道微生物区系平衡和健康的无致病性细菌，通过在机体肠道内与致病菌颉颃、免疫调节、组织修复等作用促进动物生长、发育，保障动物健康[1]。目前，抗生素的不正当使用，尤其是滥用造成超级细菌的产生和严重的药物残留等问题，不但已引起了广大学者的高度关注，在某方面也得到了许多国家政府的高度重视，故探索或寻找行之有效的抗生素替代品一直是科技工作者努力的方向和研究热点之一[2]。益生菌所具有的安全可靠，无毒副作用，无耐药残留等生物特性而得到学者的高度重视[3]。综合目前已有研究资料，对益生菌与疫苗联合应用方面的系统研究较少，故本试验旨通过T细胞对ConA增殖和IL-2 mRNA表达的检测，在细胞水平与mRNA水平阐述益生菌和ND疫苗联合免疫雏鸡后，其对雏鸡免疫器官细胞免疫功能的影响，为益生菌在动物医学界应用提供试验理论依据。

1 试验材料

1.1 试验动物 1日龄AA肉鸡100只，雌雄各半，购自哈尔滨市某孵化场，经NDV、MDV、IBDV等检测均为阴性。

1.2 益生菌 产酶益生菌，购自山东华尔康生物技术有限公司，生产批号为饲添字(2007)11178号，按产品说明书使用。

1.3 ND疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系)，购自哈药集团生物制品一厂，批号为200861， 按说明书使用。

1.4 试验动物分组及处理 100只雏鸡随机分为4组，即益生菌组(P组)、ND疫苗单独免疫组(V组)、益生菌联合ND疫苗组(P+V组)和空白对照组(C组)。其中，P组和P+V组雏鸡分别在1日龄和18日龄连续灌服益生菌稀释液3 d，1次/天(0.1mL/次，5×109CFU/mL)；V组和P+V组雏鸡分别在10日龄和21日龄经滴鼻、点眼接种LaSota弱毒苗，且21日龄免疫剂量为10日龄的2倍；C组雏鸡灌服生理盐水。

1.5 被检材料采取及处理 4组雏鸡分别于第二次接种LaSota疫苗后0、7、14、28、42 d，每组随机抽取5只雏鸡，心脏采血处死，无菌快速采取胸腺、脾脏一部分制成单细胞悬液进行组织细胞培养，用于T细胞增殖能力检测；另一部分于液氮中速冻，然后转入-80℃冰箱中冻存，用于IL-2 mRNA 表达检测。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 胸腺、脾脏T细胞增殖能力的检测 胸腺、脾脏T细胞增殖能力检测，采用细胞培养及MTT检测法[4]，于全自动酶标仪上，测定590nm下的OD值。

1.6.2 鸡免疫器官IL-2 mRNA表达量的检测 鸡IL-2 mRNA表达量测定，应用实时荧光定量PCR法[5]。

2.结果

2.1 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后胸腺、脾脏T细胞增殖能力变化 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其胸腺和脾脏中T细胞增殖能力与ND疫苗单独免疫雏鸡和益生菌单独应用雏鸡相比均不同程度升高，其中胸腺T细胞增殖能力于疫苗免疫后 7～28 d显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于ND疫苗单独免疫雏鸡及益生菌单独应用雏鸡；脾脏中T细胞增殖能力分别于疫苗免疫后7～14 d和7～28 d显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于ND疫苗单独免疫雏鸡和益生菌单独应用雏鸡(图1，2)。

图1 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后胸腺T 细胞增殖能力变化

图2 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后脾脏T细胞增殖能力变化

2.2 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后胸腺、脾脏IL-2 mRNA表达量变化 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其胸腺、脾脏IL-2 mRNA表达量于疫苗免疫后7～14 d显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于ND疫苗单独免疫雏鸡，于7～28 d也明显(P<0.05或P<0.01)高于益生菌单独应用雏鸡(图3，4)。

3.讨论

T细胞在雏鸡体内主要集中在胸腺和脾脏中，T细胞不仅可以直接杀伤靶细胞，还可调节B细胞产生抗体，对特异性抗原和有丝分裂原产生免疫应答，同时T细胞还能产生多种细胞因子，如IL-2INF-γ等发挥免疫调节作用。本研究发现，益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其胸腺和脾脏中T细胞对ConA的增殖能力较ND疫苗单独免疫雏鸡和益生菌单独应用雏鸡均有不同程度的增强，产生上述结果的可能原因是：雏鸡饲喂益生菌后，益生菌在机体肠道中定植，合成大量维生素等营养物质，促进机体免疫器官发育及功能的发挥，使胸腺和脾脏中T细胞对有丝分裂原的反应能力增强。Filho等[6]研究发现，雏鸡饲喂嗜酸性乳酸杆菌后，其肠道黏膜中CD8+T细胞和Th2细胞数量明显高于对照雏鸡；另外，益生菌其自身可作为抗原物质刺激机体免疫系统，激发免疫应答，T细胞又是机体细胞免疫的主要免疫活性细胞，其免疫应答功能的增强，表明动物机体的细胞免疫功能提高；益生菌菌体的肽聚糖和脂多糖等成分，以免疫佐剂形式作用于机体免疫器官，促进机体的免疫反应，所以当雏鸡饲喂益生菌后，机体处于高水平的免疫反应状态，LaSota弱毒苗(Ⅳ系)免疫雏鸡后，机体发生高水平的免疫反应，使T细胞增殖较ND疫苗单独免疫雏鸡更加显著。

图3 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后胸腺IL-2 mRNA表达变化

图4 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后脾脏IL-2 mRNA表达变化

益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其免疫器官中IL-2 mRNA表达均高于ND疫苗单独免疫雏鸡，说明益生菌不仅可以提高雏鸡免疫器官中T细胞增殖能力，还可促进雏鸡免疫器官IL-2 mRNA表达，其主要原因是：IL-2主要由Th1、Tc和NK细胞产生，雏鸡饲喂益生菌后，其菌体成分，如肽聚糖具有免疫刺激活性，可促进雏鸡体内巨噬细胞分泌IL-1，而后者可活化Th细胞，使其分泌大量IL-2，故益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡的免疫器官中IL-2 mRNA表达高于ND疫苗单独免疫雏鸡，而IL-2又可作用于T细胞自身的调节物，促进T细胞增殖、分化及细胞因子的产生。胸腺含有大量T细胞，所以饲喂益生菌雏鸡，其胸腺中T细胞增殖效果更加明显，且IL-2 mRNA表达量也显著增加。于志强等[7]研究发现，益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其黏膜免疫器官中IL-2 mRNA表达均高于单独应用ND疫苗免疫雏鸡及对照雏鸡，本研究结果与上述已有研究报道基本一致。

综上所述，益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡后，其胸腺、脾脏中T细胞增殖能力和IL-2 mRNA表达与ND疫苗单独免疫雏鸡和饲喂益生菌雏鸡相比均明显增加，说明益生菌能够提升机体免疫能力，益生菌联合疫苗免疫雏鸡的免疫效果显著优于疫苗和益生菌单独应用雏鸡。

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[2] Pan S J，Kuo C H，Lam K P，etal．Probiotics and allergy in children-an update review[J]．Pediatr Allergy Immunol，2010，21(42)：659-666．

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Influence of Probiotcs on T cell Proliferation Function and IL-2 mRNA Expression in Immune Organs of Chicks Vaccinated with Newcastle Disease Vaccine

BAI Yu1， LI Yan2， GAO Xue-li1， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1

(1.College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030, China ；2.Sichuan Animal Science Academy， Chengdu 610066， China)

In order to explore the effects of probiotics on the immune response in chicks vaccinated with Newcastle disease(ND)vaccine, 100 1-day-old AA broilers were randomly divided into probiotics alone group, ND vaccine alone immune group, probiotics and ND vaccine combination group, and blank control group. Test samples of chicks in each group after ND vaccination were collected at 0,7,14,28,and 42 days post vaccination. The cellular immune function and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were detected by MTT and RT-PCR. The results showed that the proliferation function of T cell in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were significanty higher(P<0.05 orP<0.01)than vaccination alone or probiotics-fed chicks at 7～28 days after vaccination. These data show that probiotics can enhance the immune efficacy of ND vaccine by enhancing the proliferation of T cells and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of chicks.

probiotic; Newcastle disease vaccine; proliferation function of T cell; IL-2 mRNA expression

ZHENG Shi-min

2016-03-25

国家自然科学基金(30972162)

白玉(1991- )，男，硕士生，主要从事动物免疫病研究，E-mail：baiyu618@sohu.com

郑世民，E-mail：zhenghsiminbl@sohu.com

S852.33

A

0529-6005(2016)11-0001-03