藏橐吾小鼠急性毒性试验

冯 柯 , 郭亚洲 , 张睿涵 , 薛瑞旭 , 王 欢 , 赵宝玉

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西杨凌712100； 2.拉萨市动物疫病预防控制中心 ， 西藏拉萨851000)

藏橐吾小鼠急性毒性试验

冯 柯1，2, 郭亚洲1, 张睿涵1, 薛瑞旭1, 王 欢1, 赵宝玉1

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西杨凌712100； 2.拉萨市动物疫病预防控制中心 ， 西藏拉萨851000)

为了研究藏橐吾地上部分水提液对小鼠的急性毒性作用, 将100只体质量30±2 g昆明系小鼠随机分成10组(灌胃6组, 腹腔注射4组), 每组10只, 雌雄各半。 灌胃给药剂量为53.00～135.00 g/kg(以生药量计), 灌胃量为1 mL/30 g, 分3次灌胃, 每次间隔4 h； 腹腔注射剂量为8.88～21.90 g/kg(以生药量计), 注射量为0.8 mL/30g, 1次腹腔注射。 给药后, 每天观察小鼠的临床表现和死亡情况, 连续观察14 d, 记录小鼠出现的毒性反应及病理剖检变化, 统计死亡数, 用改良寇氏法计算LD50。 结果表明, 小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分别为91.69 g/kg和15.75 g/kg, 95%可信限分别为83.10～101.16 g/kg和14.01～17.72 g/kg； 两种染毒方式的中毒症状相似, 均出现精神沉郁、运动迟缓、食欲及饮水废绝、呼吸频率降低； 病理剖检可见胃肠道臌气, 肝脏、脾脏坏死。 结合中毒小鼠的临床症状和病理剖检变化, 综合分析后认为藏橐吾有毒性, 主要损伤器官为胃肠道、肝脏和脾脏。

藏橐吾 ； 水提液 ； 灌胃 ； 腹腔注射 ； 急性毒性 ； 小鼠

藏橐吾(Ligulariarumicifolia)是菊科(Compositae)橐吾属(Ligularia)的多年生草本植物，产于我国西藏东南部至东北部，生于海拔3 700～4 500 m的湖边、林下、灌丛及山坡[1]。作为一味中药，藏橐吾具有散寒、化痰、止咳等功效，常用于治疗咳嗽痰喘、肺痨等症[2]。藏橐吾植株高(40～100 cm)、叶片宽大(长19 cm，宽6～10 cm)，草原发生雪灾后不易被积雪掩盖，极易被饥饿动物采食，引起中毒。与藏橐吾同样分布在青藏高原的黄帚橐吾(Ligulariavirgaurea)已造成青海贵南县143头牛、羊中毒[3]。同属网脉橐吾(Ligulariadictyoneura)和牛蒡叶橐吾(Ligularialapathifolia)被认定为有毒植物[5]。目前，国内外尚无藏橐吾化学成分及毒性的相关报道。鉴于此，本试验通过观察藏橐吾水提液小鼠灌胃和腹腔注射的急性毒性，用改良寇氏法计算LD50，同时观察小鼠的毒性反应及病理剖检变化，以评价藏橐吾的毒性，为后续亚急性毒性试验和毒性机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物样品 藏橐吾地上部分全草2014年8月采集于西藏堆龙德庆县(30°02′07.46″N；90°36′26.06″E)，晒干后粉碎，置于通风阴凉干燥处保存备用。植物标本由西北农林科技大学生命科学学院常朝阳研究员鉴定。

1.2 试验动物 昆明系小鼠，雌雄各半，体质量 30±2 g，由第四军医大学实验动物中心购进。购进后进行7 d的喂养观察，淘汰不健康小鼠。饲喂自制鼠粮。

1.3 试验方法

1.3.1 水提液的制备 取一定质量的藏橐吾粉末，加10倍量的蒸馏水文火煎煮0.5 h，取上清液，过滤，如此重复3次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至生药量为4.05 g/mL的溶液(此浓度为灌胃给药的最大浓度)，加一定量的蒸馏水配置成不同生药量的攻毒液。灌胃用的攻毒液，4 ℃保存备用，腹腔注射用的攻毒液，高压灭菌后，4 ℃保存备用。

1.3.2 半数致死量(LD50)试验 将健康小鼠随机分成10组(灌胃6组，腹腔注射4组)，每组10只，雌雄各半。试验前12 h、试验后4 h禁食，但不限制饮水。根据预试验结果，小鼠灌胃给药剂量为 53.00～135.00 g/kg(以生药量计)，剂间比为1∶0.83，灌胃量为1 mL/30g，分3次灌胃，每次间隔4h；小鼠腹腔注射剂量为8.88～21.90 g/kg(以生药量计)，剂间比为1∶0.74，注射量为0.8 mL/30g，1次腹腔注射。给药后，每天观察小鼠的临床表现和死亡情况，连续观察14 d，记录小鼠出现的毒性反应及病理剖检变化，统计死亡数。

1.4 计算方法 用改良寇氏法计算LD50及95%可信限[6]。

2 结果

2.1 灌胃染毒结果

2.1.1 LD50及95%可信限结果 灌胃后观察14 d，统计各个剂量组的死亡率(表1)，用改良寇氏法公式进行计算得出，藏橐吾地上部分水提液对小鼠灌胃的LD50为91.69 g/kg，95%可信限为 83.10～101.16 g/kg。

2.1.2 小鼠临床症状及病理剖检变化 随着灌胃剂量的增大，小鼠出现中毒症状的时间也越早。小鼠中毒临床症状不明显，仅表现为对外界声音刺激敏感，不喜动，食欲、饮水废绝。死亡主要集中在灌胃后96 h内，耐过后的小鼠恢复正常。死亡小鼠的病理剖检，主要表现为胃肠道局部臌气；肝脏边缘坏死；胸腔有积血；脾脏坏死；其余脏器未见明显肉眼变化。攻毒14 d后对存活的小鼠用颈椎脱臼法处死并进行病理剖检，脏器均未见明显肉眼变化。

表1 小鼠灌胃急性毒性正式试验结果

2.2 腹腔注射染毒结果

2.2.1 LD50及95%可信限结果 腹腔注射后观察14 d，统计各个剂量组的死亡率(表2)，用改良寇氏法公式进行计算得出，藏橐吾地上部分水提液对小鼠腹腔注射的LD50为15.75 g/kg，95%可信限为14.01～17.72 g/kg。

表2 小鼠腹腔注射急性毒性正式试验结果

2.2.2 小鼠临床症状及病理剖检变化 腹腔注射后，随着攻毒剂量的增大，小鼠出现中毒症状的时间也越早，症状也越明显。主要症状包括精神沉郁，不喜动，食欲、饮水废绝，呼吸频率降低。最高剂量组在临死前出现乱窜、后肢抽搐等症状，多数在注射后6 min内死亡。其余剂量组表现出对外界声音刺激不明显，临死前出现后肢麻痹、僵硬等症状。绝大部分死亡集中发生在注射后的24 h内，耐过的小鼠在出现精神沉郁后恢复正常。对死亡小鼠进行病理剖检，发现胃肠道局部臌气，胃下部及小肠充血；心尖、肝脏、脾脏坏死；其余脏器未见明显肉眼变化。攻毒14 d后对存活的小鼠用颈椎脱臼法处死并进行病理剖检，脏器均未见明显肉眼变化。

3 讨论与结论

本试验通过改良寇氏法计算得出，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50为91.69 g/kg，95%可信限为 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50为15.75 g/kg，95%可信限为14.01～17.72 g/kg。结合中毒小鼠的临床症状和死后病理剖检变化，综合分析后认为藏橐吾有毒性，主要损伤器官为胃肠道、肝脏、脾脏。

通过两种不同的染毒途径可以看出，灌胃和腹腔注射的中毒症状相似，均出现精神沉郁、不喜动、食欲和饮水废绝、呼吸频率降低和胃肠道臌气，肝脏、脾脏坏死等临床表现和病理剖检变化。

本试验初步研究发现，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50为91.69 g/kg，95%可信限为 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50为15.75 g/kg，95%可信限为14.01～17.72 g/kg。结合中毒小鼠的临床症状和死后病理剖检变化，综合分析后认为藏橐吾有毒性，主要损伤器官为胃肠道、肝脏、脾脏。灌胃和腹腔注射的中毒症状相似，均出现精神沉郁、不喜动、食欲和饮水废绝、呼吸频率降低和胃肠道臌气，肝脏、脾脏坏死等临床表现和病理剖检变化。后续试验可以进一步探究藏橐吾的主要有毒成分及其靶器官。

[1] 傅坤俊,张振万,何善宝,等.中国植物志.第77(2)卷[M].北京:科学出版社, 1993:47.

[2] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京:科学出版社,1994:1318.

[3] 林永明.牛羊黄帚橐吾草中毒症的诊治[J].中国草食动物,2011,3:74-75.

2015-11-05

农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)

冯柯(1982- )，男，硕士，主要从事动物中毒病与毒理学研究，E-mail: John3376@qq.com

赵宝玉，E-mail:zhaobaoyu12005@163.com

S859.87

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0529-6005(2016)11-0113-02