Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及定位检测

唐 娟 ， 张 曼 ， 金 鑫 ， 刘 骄 ， 田巧珍 ， 王云鹤 ， 杨银凤

(1.内蒙古农牧业科学院兽医研究所， 内蒙古呼和浩特 010031； 2.内蒙古农业大学兽医学院， 内蒙古呼和浩特 010018)

Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及定位检测

唐 娟1， 张 曼2， 金 鑫2， 刘 骄2， 田巧珍2， 王云鹤2， 杨银凤2

(1.内蒙古农牧业科学院兽医研究所， 内蒙古呼和浩特 010031； 2.内蒙古农业大学兽医学院， 内蒙古呼和浩特 010018)

通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学技术对Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及定位进行初步研究。 RT-qPCR结果显示，Ghrelin在驯鹿胃肠道内均有表达， 且在皱胃内表达量极显著高于其他组织(P<0.01)， 其次是十二指肠、 回肠和结肠； 免疫组织化学结果显示， Ghrelin免疫阳性细胞在皱胃内主要分布于黏膜层、 黏膜下层和肌层； 在瘤胃、 网胃、 瓣胃的黏膜层、 黏膜下层中也可见Ghrelin的免疫阳性细胞， 但肌层中未见表达； 在十二指肠、 空肠、 回肠、 结肠的黏膜层、 黏膜下层和肌层均有Ghrelin免疫阳性细胞分布， 且在肠绒毛和黏膜下层分布较多。 RT-qPCR和免疫组织化学结果显示，Ghrelin在胃肠道内表达量及分布范围基本一致， 这表明Ghrelin对驯鹿的消化可能具有潜在的调控作用。

Ghrelin； 驯鹿； 实时荧光定量PCR； 免疫组织化学

Ghrelin最早是由日本学者Kojima等[1]在人和鼠的胃中分离出来的一种含有28个氨基酸残基的多肽，是生长激素促分泌素受体1a(growth hormone secretagogue receptor 1a，GHS-R1a)的一个内源性配体。据报道，这28个氨基酸序列在鱼类、鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物体内显著保守[2]。研究发现，Ghrelin免疫阳性细胞分布于啮齿类动物胃肠道的各个部位。其中在胃黏膜层中分布最密集；在肠隐窝和绒毛的上皮细胞分布较多，并随着消化管向后延伸数量大幅度减少[3]。Hayashida等[4]用免疫组织化学方法发现Ghrelin密集分布于牛、绵羊、猪、马和大鼠胃腺的颈部至底部，特别在猪的贲门和幽门区分布较多。而关于Ghrelin在驯鹿这种野生动物身上的研究报道很少，目前相关的究研仅局限于驯鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析[5]。因此，本试验采用RT-qPCR和免疫组织化学等方法对驯鹿胃肠道内Ghrelin的相对表达量及细胞定位进行了研究，以探索Ghrelin对驯鹿胃肠道消化的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品制备 成年雄性驯鹿由内蒙古大兴安岭北敖鲁古雅民族自治乡提供。驯鹿屠宰后立即刮取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠等组织黏膜，并切取适量组织块用生理盐水清洗后放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定24 h。

1.2 相对定量

1.2.1 引物设计 根据本课题组呈送到GenBank中的驯鹿Ghrelin部分mRNA序列和跨内含子引物设计原则设计一对特异性PCR引物P1、P2。另外根据驯鹿18S rRNA序列设计另外一对PCR引物P3、P4。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物(Primer1)序列为: 5′-AACGCCCCCTTTGACATTGG-3′；

下游引物(Primer2)序列为：5′-TGAGGGTGGGGAACGGACAG -3′；

上游引物(Primer3)序列为：5′-CCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC-3′；

下游引物(Primer4)序列为：5′-TGATGCCCCCGACTGTCCCTATTA -3′。

1.2.2 总RNA的提取和反转录反应 总RNA的提取按照Total RNA提取试剂盒(TaKaRa公司日本，9108)说明书进行操作。反转录反应使用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)试剂盒进行操作。

1.2.3 RT-qPCR 采用SYBR Green II荧光染料进行RT-qPCR检测，按其说明书进行操作。每个样品的18S rRNA和Ghrelin基因分别做5个重复。由于Ghrelin和18S rRNA的扩增效率均接近等于1，因此采用2-ΔCT公式进行相对表达量的计算[6]，△Ct=CtGhrelin-Ct18S rRNA。

1.3 免疫组织化学染色 将固定好的组织样品冲水过夜，经脱水、透明、浸蜡及包埋，制成石蜡连续切片。切片厚度为4-5 μm。按照SABC免疫组织化学试剂盒说明书进行操作，其中一抗为稀释度1∶200的兔抗人、大鼠、小鼠、兔抗Ghrelin多克隆抗体，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。经苏木精复染，脱水和透明后中性树胶封固，镜检。阴性对照以PBS缓冲液取代一抗，其他步骤同上。

1.4 数据统计分析 用Graphpad Prism 5软件进行单因子方差分析，每组重复5次，检验结果以P<0.01 代表差异极显著，P<0.05代表差异显著。

2 试验结果

2.1 Ghrelin相对表达量 RT-qPCR检测结果经Graphpad Prism 5软件分析发现，Ghrelin在驯鹿胃肠道内均有表达且相对表达量差异显著(图1)，Ghrelin在皱胃内的表达丰度极显著高于其他器官(P<0.01)，其次是十二指肠、 回肠、结肠、瓣胃，且上述器官与瘤胃、网胃、空肠等器官内的表达量相比差异显著(P<0.05)。

图1 Ghrelin在驯鹿胃肠道的相对表达量**：P <0.01；*：P <0.05

2.2 Ghrelin阳性细胞的分布 经免疫组织化学染色结果显示，Ghrelin免疫阳性细胞主要分布于瘤胃、网胃、瓣胃的黏膜层和黏膜下层，染色呈淡棕色，肌层未见阳性染色(见中插彩版图2：A1、B1、C1)；在皱胃内大多散在分布于黏膜上皮和腺颈部，少数分布于腺体部和腺底部，黏膜下层和肌层也可见较强的阳性信号(见中插彩版图2：D1、D2)；在十二指肠内Ghrelin的阳性细胞在黏膜层、黏膜下层和肌层均有分布(见中插彩版图3：E1)，其中肠绒毛上皮和黏膜下层阳性染色呈深棕色，十二指肠肠腺着色不明显(见中插彩版图3：E2)；空肠内的Ghrelin阳性细胞主要集中在黏膜层和黏膜下层，固有层肠腺和肌层着色不明显(见中插彩版图3：F1)；回肠主要分布在黏膜层、黏膜下层和肌层，固有层肠腺着色不明显(见中插彩版图3：G1)；结肠则主要位于黏膜上皮，其次是黏膜下层，肌层未见阳性表达(见中插彩版图3：H1)。上述各阴性对照组均未发现阳性信号(见中插彩版图2、图3：A3-H3)。

3 讨论

Ghrelin 是生长激素领域里的一个重要发现。它的发现使我们对生长激素调节系统和胃肠功能等调节机制有了更深入的了解。目前，关于反刍动物消化道Ghrelin的研究也在持续增多。Wang等[7]通过检测0～56日龄羔羊胃肠道内Ghrelin的表达，结果显示，在皱胃内Ghrelin的表达量远高于其他胃肠组织。王家乡等[8]通过RT-PCR法研究Ghrelin在非洲雏鸵鸟胃肠道内的分布变化，结果显示，Ghrelin除在空肠、结肠不表达外，在消化道的其他部位均有表达。本试验采用RT-qPCR和免疫组织化学等方法对Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及分布进行了检测。结果发现，皱胃、十二指肠、回肠、结肠内Ghrelin的表达量和免疫阳性细胞分布均显著高于瘤胃、网胃、瓣胃、空肠(P<0.05)，且在驯鹿胃肠道的黏膜层、黏膜下层都可见免疫阳性反应。

于高水等[9]研究，Ghrelin在撒能奶山羊胃肠道的分布与表达，结果发现，Ghrelin阳性细胞在胃肠道黏膜层均可被检测到。本试验证实，在驯鹿体内Ghrelin免疫阳性细胞分布于整个消化管的黏膜层，说明反刍动物在表达Ghrelin上可能存在种属特异性。本试验还发现，在瘤胃、网胃、瓣胃内Ghrelin mRNA和蛋白表达均比较低。Ghrelin阳性细胞在驯鹿皱胃、十二指肠、空肠、回肠的分布特点与黑麂[10]、济宁青山羊[11]和鼠[12]相一致，黏膜层、黏膜下层和肌层都可见免疫阳性细胞的分布，提示Ghrelin可能对驯鹿胃肠功能和胃酸的分泌发挥调节作用。

[1] Kojima M, Hosoda H, Date Y,etal. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J]. Nature, 1999, 402 (6762): 656-660.

[2] Kaiya H, Miyazato M, Kangawa K,etal. Ghrelin: a multifunctional hormone in non-mammalian vertebrates[J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2008, 149:109-128.

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[4] Hayashida T, Murakami K, Mogi K,etal. Ghrelin in domestic animals: distribution in stomach and its possible role[J]. Domest Anim Endocrinol, 2001, 21(1):17-24.

[5] 杨银凤, 余兴邦, 王冠玉. 中国驯鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析[J]. 中国兽医学报, 2014, 34(1): 1647-1652.

[6] Shao Y J, Liu SH Q, Tang X Y,etal. Ontogeny of ghrelin mRNA expression and identification of ghrelin immu-nopositive cells in the gastrointestinal tract of the Peking duck, Anas platyrhychos[J].Gene Comp Endocrinol, 2010, 166: 12-18.

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[8] Wang J X, Li P, Peng K M,etal. cDNA cloning of ghrelin and ontogeny of ghrelin mRNA expression in the gastrointestinal tract of African ostrich chicks[J]. Regul Pept, 2011, 167:50-55.

[9] 于高水, 张文龙, 黄勇, 等. Ghrelin在撒能奶山羊胃肠道内的分布与表达[C].北京：兽医病学会论文集, 2012：45(7): 156-157.

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[11] 张德敏. 济宁青山羊胃肠道Ghrelin免疫阳性细胞与小肠组织结构的发育性变化[D]. 泰安: 山东农业大学, 2012.

[12] Dass N B, Munonyara M, Bassil A K,etal. Growth hormone secretagogue receptors in rat and human gastrointestinal tract and the effects of Ghrelin[J]. Neuroscience, 2003, 120(2): 443-453.

The examination of expression andlocalization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract

TANG Juan1, ZHANG Man2, JIN Xin2, LIU Jiao2, TIAN Qiao-zhen2,WANG Yun-he2, YANG Yin-feng2

(1. Academy of Agriculture and Animal Husbandry in Inner Mongolia, Hohhot 010031， China;2. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010018,China)

The RT-qPCR and Immunohistochemistry were used to examine the expression and localization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract. The results of RT-qPCR indicated that the expression in the abomasum was significantly higher than that in other organs(P<0.01), followed by duodenum, ileum and colon. Immunohistochemical staining results showed that Ghrelin-positive cells in the abomasum were mainly distributed in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis and also detected in the tunica mucosa, tunica submucosa of rumen, reticulum, omasum. Ghrelin-positive cells were mainly localized in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis of duodenum, jejumum, ileum, and colon. Especially more cells were found in the epithelium of intestinal villi and the tunica submucosa. RT-qPCR and immunohistochemistry indicated that Ghrelin was presented in gastrointestinal tract, suggesting its possible role in regulating the digestive function.

Ghrelin; reindeer; RT-qPCR; Immunohistochemistry

YANG Yin-feng

2016-06-29

内蒙古自然科学基金(2013MS0408)

唐娟(1965- )，女，副研究员，本科，主要从事中兽药的研发,E-mail:tangjuan12002@163.com；张曼(1990- )，女，博士生，主要从事动物解剖及分子生物研究，E-mail：zhangman90514@163.com

杨银凤，E-mail：julie1963@163.com

S865.4†2

A

0529-6005(2016)11-0040-03

注：张曼与唐娟对本文具有同等贡献