咪达唑仑对山羊不同脑区cAMP含量的影响

郭 岑 ， 郑 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李丽娜 ，张一鸣 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

咪达唑仑对山羊不同脑区cAMP含量的影响

郭 岑 ， 郑 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李丽娜 ，张一鸣 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

研究咪达唑仑对山羊不同脑区cAMP含量的影响，探讨其在中枢麻醉中的作用机制。试验用15只健康山羊，3只为生理盐水对照组，其余为试验组，试验组山羊肌肉注射14mg/kg体重咪达唑仑。分别在给药后诱导期、麻醉期、恢复1期和恢复2期4个时间点，每个给药点剖杀3只山羊取脑组织，并采用ELISA测定不同脑区cAMP含量。注射咪达唑仑后，山羊大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干内cAMP含量显著升高，恢复2期上述脑区内cAMP含量均恢复到正常水平，这种变化趋势与山羊肌肉注射咪达唑仑麻醉后行为学变化基本一致。表明咪达唑仑的麻醉作用可能与激活山羊各个脑区内cAMP信号转导系统相关。

咪达唑仑 ； cAMP ； 山羊

咪达唑仑(Midazolam、Dormicum)是苯二氮卓类麻醉剂，具有镇静、安眠、抗焦虑、肌肉松弛作用[1]。但其麻醉辅助药物对中枢作用机制目前还没有系统的研究。cAMP 作为第二信使，具有调控细胞基因和蛋白表达的重要功能[2]，腺苷酸环化酶(AC)在接收胞外信号跨膜抵达胞内时，在Mg2+存在时，环化ATP 转化为cAMP，cAMP 激活蛋白激酶(PKA)磷酸化目标蛋白或使目标基因转录，进而使细胞内各项生理生化反应被激活。近些年，许多试验数据逐步证实cAMP 信号通路在麻醉过程中发挥着相应的关联作用。有报道证实，噻环乙胺麻醉可显著提高大鼠的丘脑和大脑皮质内的腺苷酸环化酶(AC)活性，增加cAMP 的含量[3-4]。唐苏红等[5]人用丙泊酚麻醉大鼠，测定麻醉各时期脑干、海马以及大脑皮层内cAMP 含量。结果发现，在麻醉期，大鼠各脑区的cAMP 含量明显升高，而恢复期cAMP 含量则呈下降趋势，逐步回归正常水平，从而推测大鼠脑干、海马以及大脑皮层的cAMP 含量变化可能是丙泊酚引发中枢抑制作用的原因之一。此外，李平萍等[6]人使用氯胺酮、依托咪酯、咪达唑仑、异氟烷等药物做类似研究，都得出了麻醉期相关脑区cAMP 含量升高的结果，说明动物麻醉可能伴随相应脑区cAMP的含量变化。试验设计研究咪达唑仑对山羊各个脑区cAMP含量的影响，利用山羊研究该药的麻醉中枢作用机制，以探讨咪达唑仑对山羊麻醉的中枢作用机制及其在中枢神经系统的主要作用位点，为今后该药物在反刍动物临床应用提供依据。

1 试验材料及方法

1.1 试验用品

1.1.1 试验动物 八月龄健康山羊15只(购自哈尔滨郊区养殖户，医学检查健康)，体重13～15 kg，雌雄兼用，试验前在动物舍喂养1周以适应环境。试验前12 h禁食禁水。

1.1.2 仪器和药品 AvantiTM30Centrifuge高速冷冻离心机(Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM)；多体积分光光度计(美国伯腾仪器有限公司)。咪达唑仑注射液，由哈尔滨医科大学提供；山羊cAMP测定试剂盒，购自美国R&D systems公司。

1.2 动物分组及样品采取 15只山羊随机分为两组：对照组(生理盐水组)3只、麻醉诱导组(注药后5 min)、麻醉组(翻正反射消失)、恢复1组(翻正反射恢复时)、恢复2组(翻正反射恢复后6 h)4个时间点每个时间点3只。对照组与麻醉组分别肌肉注射生理盐水1.5 mL/kg体重，咪达唑仑14 mg/kg体重，并于各时间点处死开颅，取脑组织，用4 ℃生理盐水冲净脑组织血液，置于冰面上迅速分取双侧大脑皮层、小脑、丘脑、脑干和海马。称重后按1∶9(W/V)置入预冷的生理盐水溶液中匀浆，然后 -4 ℃ 高速离心10 min(3 000 r/min)，取上清液。行为学变化按照师铭咸等[7]所述标准判定。

1.3 检测方法 采用ELISA方法检测样品中cAMP含量。上步所采取的样品按照所用ELISA试剂盒要求进行进一步处理后，用ELISA方法检测各样品中cAMP含量。

2 试验数据的统计与分析

应用SPSS13.0for Windows数据统计分析软件，对数据进行一维方差分析，两变量间简单相关分析采用直线相关回归分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。应用Microsoft Excel 2007对试验数据进行作图。

3 试验结果与分析

咪达唑仑麻醉下山羊行为学变化 注药后山羊表现如下：逐渐安静，行动迟缓、共济失调、趴卧不动，最后翻正反射消失。测定翻正反射消失所用平均时间为8.46±2.67 min。在麻醉期间，山羊双目半闭，眼球向内下方翻转，对光反射存在。眼睑反射、角膜反射明显减弱，肛门反射存在，较少出现流涎。翻正反射恢复的平均时间为45.68±4.52 min。

如表1所示，注射咪达唑仑后，山羊大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干内cAMP浓度都明显增高。诱导期大脑皮层、海马、丘脑和脑干内cAMP浓度与对照组比较，分别增高17.8%(P<0.01)、23.1%(P<0.01)81.6%(P<0.01)、5.3%(P>0.05)和5.4%(P>0.05)，差异不显著或极显著。麻醉期大脑皮层、海马、丘脑、小脑和脑干内cAMP浓度与对照组比较，分别增高24.0%、35.6%、92.4%、25.8%和14.0%，均差异极显著。恢复1期各个脑区cAMP浓度虽有不同程度的降低，但与对照组比较，分别增高14.4%(P<0.05)、20.6%(P<0.01)、46.6%(P<0.01)、15.2%(P<0.01)和 10.9%(P<0.01)差异显著或极显著。恢复2期上述脑区cAMP浓度，恢复到正常水平。山羊各个脑区cAMP含量变化趋势与山羊行为学变化呈现一定规律性。

4 讨论

cAMP普遍存在于细胞内，是一种重要的第二信使。细胞内，活化的腺苷酸环化酶(AC)催化胞浆中的ATP脱去一个焦磷酸产生cAMP，cAMP进一步激活细胞中的蛋白激酶(PKA)，介导靶蛋白磷酸化，从而调节细胞的生理反应。cAMP还可通过PKA调节与麻醉有关的受体(如NMDA受体、GABA受体等)和通道(如钠离子通道)从而影响突触的兴奋传递。cAMP信号转导系统可，通过PKA使钠通道蛋白质磷酸化，减少钠离子内流，减弱神经元之间的兴奋传递，从而使机体产生麻醉反应[3]。

表1 咪达唑仑麻醉对山羊不同脑区cAMP浓度的影响 (单位：nmol/mL)

a：**：与对照组比较P<0.01，差异极显著；*：与对照组比较P<0.05，差异显著

b：▲▲：与麻醉期比较P<0.01，差异极显著；▲：与对照组比较P<0.05，差异显著

郁丽娜等(2001)研究发现，咪达唑仑对异丙酚引起小鼠不同程度大脑皮质cAMP含量变化无明显影响，但在小鼠翻正反射消失这一时点，咪达唑仑和异丙酚组小鼠大脑皮质cAMP含量与生理盐水组和异丙酚组相比，增加15.8%，有增加趋势[8]。这与本试验的结果有相似之处，表明咪达唑仑通过激活神经细胞的cAMP信号转导系统产生抑制性神经调节。Cao等(2005)预先给大鼠使用咪达唑仑，可抑制吗啡戒断大鼠脊髓Fos蛋白表达，也间接证明本试验结果的正确性[9]。

本试验结果表明，咪达唑仑麻醉过程中，诱导期山羊各个脑区内cAMP含量均明显升高，麻醉期上述脑区内cAMP含量均极显著高于对照组。在恢复1期，大脑皮层、海马和脑干内cAMP含量有明显升高，在翻正反射恢复并能自由走动后，各脑区cAMP的浓度均有所降低，基本恢复到正常水平，这种变化趋势与山羊行为学变化相平行。分析试验结果推断，山羊各个脑区的cAMP信号转导系统可能参与咪达唑仑全麻分子机理的调控，且咪达唑仑全麻作用可能与激活上述脑区的cAMP信号转导系统相关。另一方面，咪达唑仑能够直接作用于GABAA受体的苯二氮位点，修饰GABAA受体的活动(控制Cl_通道)。两者之间可能存在协同作用。Juan-Fita等(2006)研究发现，应用地西泮能增强多巴胺刺激大鼠心肌产生cAMP的作用，这一效应不能由苯二氮卓类受体诱导，可能是地西泮抑制PDE同工酶4活性的结果[10]。咪达唑仑同为苯二氮卓类麻醉剂，是否通过相同的机制对cAMP信号转导系统产生作用，还需要进一步的研究。

5 结论

本研究表明，cAMP信号转导系统可能参与了咪达唑仑全麻分子机理的调控。咪达唑仑的全麻作用可能与激活山羊各个脑区的cAMP信号转导系统相关。

[1] 华盼金.咪达唑仑不同给药方式治疗儿童急性惊厥疗效观察[J].当代医学，2011，17(25)：151-152.

[2] 冯昌栋，杨建平，戴体俊.七氟烷吸入麻醉对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].中国药理学通报，2008，24(12)：1678-1679.

[3] Joseph R R.Prostaglandins and activation of AC/cAMP prevents anoikis in IEC-18[J].Apoptosis，2005，10(6)：1221-1233.

[4] Seo J J，Lee J W，Lee W K，etal.Inhibitory effects of ginseng total saponin on up-regulation of cAMP pathway induced by repeated administration of morphine[J].Archives of Pharmacal Research，2008，31(2)：167-170.

[5] 唐苏红，冯昌栋.丙泊酚对大鼠脑内cAMP含量的影响[J].中国民康医学，2009，21(20)：2463.

[6] 李平萍，李士云，李彦东，等.氯胺酮对大鼠皮层和丘脑cAMP含量的影响[J].山东医药，2002，42(31)：14-15.

[7] 师铭咸，刘子睿，张宇，等.咪达唑仑对山羊不同脑区NO/cGMP信号转导系统的影响[J].中国兽医学报，2015，35(1)：109-111.

[8] 郁丽娜，段世明，王钧，等.咪达唑仑和氟马西尼对异丙酚麻醉小鼠大脑皮质环腺苷酸含量的影响[J].徐州医学院学报，2001，21(5)：347-349.DOI：10.3969/j.issn.1000-2065.2001.05.002.

[9] Cao J L，Ding H L，He J H，etal.The spinal nitric oxide involved in the inhibitory effect of midazolam on morphine-induced analgesia tolerance[J].Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2005，80：493-503.

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Effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats

GUO Cen ， ZHENG Yu ， WEI Cheng-wei ， WANG Hao ， LI Li-na ， ZHANG Yi-ming ，WANG Yu-xin ， LI Xin-ran ， GAO Li

(College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats and to explore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscularly injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were executed respectively in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after induction and the brain tissues were taken immediately.CAMP content was measured by ELISA in different brain areas.The results showed that the cAMP content in cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem was significantly increased and was restored to normal levels in recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II.This trend was consistent with behavioral change of goats after midazolam anesthesia.The anesthesia effect of midazolam may be related to activating the cAMP signal transduction system in various encephalic regions of goats.

midazolam ； cAMP ； goat

GAO Li

2015-10-21

国家自然科学基金面上项目(31372491，31572580)

郭岑(1992-)，女，硕士生，从事兽医麻醉研究工作，E-mail：554892820@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.791

A

0529-6005(2016)11-0115-03