在肝脏肿大和产蛋率下降综合征病鸡中检出禽戊型肝炎病毒核酸

刘宝元 ， 孙亚妮 ， 陈宜阳 ， 赵 钦 ， 周恩民

(西北农林科技大学动物医学院 农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站， 陕西杨凌712100)

在肝脏肿大和产蛋率下降综合征病鸡中检出禽戊型肝炎病毒核酸

刘宝元 ， 孙亚妮 ， 陈宜阳 ， 赵 钦 ， 周恩民

(西北农林科技大学动物医学院 农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站， 陕西杨凌712100)

为弄清辽宁某蛋鸡场鸡只产蛋量突然下降， 死亡率上升及部分剖检鸡只肝脏肿大出血的原因， 对采集的发病鸡肝脏组织进行病理学观察， 同时对肠道内容物进行禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus, HEV)核酸片段的RT-PCR检测。 肝脏的组织病理学观察发现， 肝细胞坏死和汇管区周围淋巴细胞浸润；RT-PCR从肠道内容物中成功扩增到禽HEV ORF2基因的部分片段；基因序列同源性分析结果表明， 其与国内禽HEV参考株的序列同源性为97.5%～99.6%， 而与其他国家的HEV序列同源性为77.9%～97.6%；进化树分析表明， 该序列(命名为China 15-LN)与国内其他地区及欧洲的部分分离株在同一进化分支上， 同属禽HEV基因3型。

禽戊型肝炎病毒 ； 分离鉴定 ； 序列分析

禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是鸡的大肝大脾病(Big liver and spleen disease, BLS)或肝炎脾大综合征(Hepatitis-Splenomegaly, HS)的主要病原，该病主要引起30～72周龄的蛋鸡和肉种鸡产蛋率下降(20%～40%)和死淘率升高(1%～4%)，部分鸡腹部充血、卵巢退化、偶有肝脾肿大，是危害养禽业尤其是蛋鸡和种禽养殖业发展的重要疾病之一[1]。许多国家先后有过BLS或HS综合征暴发的报道[2-9]。

2015年7月辽宁某海蓝褐蛋鸡场的鸡只(30周龄)产蛋率突然下降约30%，同时伴随死淘率上升4%左右，部分鸡只剖检症状表现肝脏肿大、出血和坏死。依据临床表现和剖检病变，初步怀疑为由禽HEV感染引发的鸡BLS。随后，通过对病死鸡肝脏的病理学观察和对肠道内容物中禽HEV核酸的RT-PCR检测进行实验室诊断。结果发现，肝脏的肝细胞严重坏死并且汇管区周围出现严重的淋巴细胞浸润，而肠道内容物中也扩增到禽HEV核酸片段。试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 解剖学及病理学观察 对病死鸡进行剖检，肉眼观察肝脏组织的病变，同时取小块肝组织于10%福尔马林液固定，常规方法制作石蜡切片并进行 H.E.染色。最后在普通光学显微镜下观察病理学变化。

1.2 病毒基因的克隆扩增与序列分析

1.2.1 样品采集与处理 收集病死鸡肠道内容物，用无菌PBS(pH值=7.2)按照质量体积比制成10%悬浮液，3 500 r/min(4℃)离心10 min，吸取200 μL上清液用于病毒RNA提取。

1.2.2 样品中禽HEV RNA检测 参考Z F Sun等的方法[10]，合成扩增ORF2部分序列的巢式PCR引物，目的片段分别为278 bp和242 bp。首先按照TRIZol和Superscript II 反转录酶(Invitrogen)的使用说明书，从200 μL肠道内容物上清液中进行总RNA的提取与反转录。然后按照Transtaq High Fidelity DNA 聚合酶(TransGen Biotech)说明书进行巢式PCR扩增，最后取5 μL PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳30 min，凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。

1.2.3 序列测定与分析 按照EasyPure Quick Gel Extraction试剂盒(TransGen Biotech)的说明书对PCR产物进行凝胶回收纯化，然后与pMD18-T Vector连接，阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将获得的序列利用DNAStar软件进行分析，并与GenBank上禽HEV的参考序列进行同源性和进化树分析。所用参考序列的GenBank登录号为：GQ398041，GQ398042，AY870827，FM872317，FM872312，AY870829，EU919193和FM872314。

2 结果

2.1 病死鸡肝脏的解剖学及病理学观察 剖检可见部分病死鸡只肝脏肿大、出血(见中插彩版图1A)。显微镜观察发现，病死鸡肝脏的肝细胞严重坏死，汇管区周围大量淋巴细胞浸润(见中彩插版图1B)，呈现出典型禽HEV感染鸡只后引发的肝脏显微病理学变化。并未观察到J亚群禽白血病引发的骨髓样细胞瘤病变(瘤细胞胞浆内有红染颗粒)。

2.2 禽HEV核酸检测与分析

2.2.1 禽HEV核酸扩增 收集的样品提取总RNA后，利用禽HEV的特异性检测引物，巢式RT-PCR方法扩增得到了预期的目的片段，其大小为 242 bp(图2)。

图2 PCR扩增结果

M：Trans2K ® Plus II DNA Marker； 1-3：样本； 4：阴性对照

2.2.2 序列分析 利用DNAStar软件包里的MegAlign程序，将获得的序列与GenBank上参考序列进行同源性分析，结果显示，其与国内的禽HEV参考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性为97.5%-99.6%，与澳大利亚，美国，西班牙，德国和匈牙利等国的参考序列的同源性为77.9%-97.6%(表1)。同源性分析提示，获得的序列为禽HEV核酸序列，命名为China 15-LN。

表1 部分禽HEV ORF2基因序列与GenBank上部分禽HEV序列同源性分析 %

利用DNAStar软件包里的Clustal W程序构建进化树，结果显示，China 15-LN与国内禽HEV及欧洲的和美国部分分离株在同一进化分支上，同属于禽HEV基因3型(图3)。

3 讨论

本次发病，蛋鸡场的鸡只在30周龄时出现产蛋量突然下降约30%，同时伴随鸡只死淘率上升4%左右，鸡场中禽流感和新城疫抗体效价均在免疫保护范围内，抗生素治疗效果不佳。通过对病死鸡进行剖检，发现部分鸡只肝脏肿大、出血，但并没有出现大小不一的结节状或块状肿瘤。依据临床表现和剖检病变，我们初步怀疑此次疫情可能是由禽HEV感染引发的鸡BLS病。随后我们通过对病死鸡肝脏的病理学观察和肠道内容物的RT-PCR检测，发现肝脏呈现典型禽HEV感染鸡只后引发的肝脏显微病理学变化[11]，而肠道内容物也扩增到禽HEV RNA。实验室诊断验证了此次疫情是由禽HEV感染引发。

图3 禽HEV部分ORF2基因序列构建的进化树

禽HEV和禽白血病感染引发的临床表现相似，但是通过对肝脏的剖检病变和显微病理学病变的观察可对两种病进行鉴别诊断。本次疫情剖检鸡只肝脏并未出现大小不一的结节状或块状肿瘤，而显微病理学也并未观察到肝脏内出现骨髓样细胞瘤病变[12](瘤细胞胞浆内有红染颗粒)，说明此次疫情不是禽白血病。

同源性分析结果显示，其(China 15-LN)与国内的禽HEV参考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性为97.5%～99.6%，与部分国家的参考序列的同源性为77.9%～97.6%。构建进化树显示，其与国内禽HEV及欧洲的和美国部分分离株在同一进化分支上，同属于禽HEV基因3型。上述结果说明，我国可能仍主要存在禽HEV基因3型的感染[7]，是否存在其他基因型仍需要进一步的流行病学调查。

通过临床和实验室诊断可以确定该鸡场此次疫情是由禽HEV感染引发的。目前尚无特效疫苗和治疗药物，但是禽HEV属于自限性疾病，产蛋量下降通常会持续3-10周，然后会恢复到接近正常水平，但是如果与其他病原混合感染可能诱发更严重的疾病表现。所以该鸡场首先应该及时清理传染源，加强饲养管理，避免进一步感染健康鸡，减少经济损失；其次减少应激，避免鸡群免疫力下降；最后鸡群饲喂保肝护肝药物，增强群体免疫力。

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2016-03-16

国家自然科学基金(31372464；31402233)；西北农林科技大学基本科研(2452016048)

刘宝元(1985- )，男，博士生，主要从事分子病原学与兽医免疫学的研究，E-mail:lby358891054@126.com

周恩民，E-mail:zhouem@nwsuaf.edu.com

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0035-03