葛根素对热应激致牛睾丸支持细胞氧化损伤的保护作用

丛 霞 ， 张东君 ， 任婷婷 ， 张 倩 ， 朱丽萍 ， 李 琪 ， 曹荣峰 ， 田文儒 ， 李华涛

(1.青岛农业大学动物科技学院， 山东青岛266109 ； 2.肥城市畜牧兽医局山东肥城271600)

葛根素对热应激致牛睾丸支持细胞氧化损伤的保护作用

丛 霞1， 张东君2， 任婷婷1， 张 倩1， 朱丽萍1， 李 琪1， 曹荣峰1， 田文儒1， 李华涛1

(1.青岛农业大学动物科技学院， 山东青岛266109 ； 2.肥城市畜牧兽医局山东肥城271600)

葛根素(Pue)是从中药野葛或甘葛藤根中提取的黄酮类化合物， 有明显的抗氧化功能。 Pue是否有对热应激时牛睾丸支持细胞 (SCs)保护作用尚不清楚。 本研究采用42 ℃热应激1 h， 然后34 ℃恢复6 h。 用CCK-8检测细胞存活率； 用Hoechst33258检测细胞凋亡； 用分光光度法检测细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的变化， 以及Western-Blot检测HSP70蛋白表达。 结果显示， 热应激后细胞存活率下降， 细胞发生凋亡， 产生氧化损伤。 葛根素和维生素E可以极显著降低热应激时细胞MDA含量， 显著增加SOD、 CAT和GSH-Px活力。 Pue与维生素E组相比无显著性差异。 此外， 葛根素可显著增加受热应激SCs中HSP70蛋白的表达。 上述结果表明， 葛根素能减少热应激下SCs的氧化损伤， 其机制可能与提高抗氧化酶活性及增加热休克蛋白HSP70的表达有关。

牛睾丸支持细胞； 葛根素； 热应激； HSP70 ；氧化损伤

夏季环境温度过高，能直接或间接影响雄性家畜的精子活力，能使种公畜精液品质下降，从而降低繁殖力。睾丸支持细胞(Sertoli Cells，SCs)又称为精子的保育细胞，参与构成血睾屏障，在生殖过程中起着重要作用，支持细胞数量多少和质量高低直接决定着雄性的生殖功能[1]。睾丸对高温较敏感，热应激能诱发猪睾丸细胞氧化损伤[2]，使小鼠睾丸质量下降，生精细胞凋亡[3]，据报道，葛根素对缺血再灌注损伤保护作用显著，并有较强的抗氧化作用，对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤保护效果明显[4]，但是葛根素能否缓解热应激所致的SCs的氧化损伤作用，目前还未见报道。本研究观察葛根素对热应激诱导的SCs氧化损伤的影响，揭示葛根素对SCs细胞受热应激的影响及其可能的作用机制，为预防动物夏季热应激寻找方法和途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 葛根素(江西本草天工)；维生素E(Sigma)；CCK-8细胞活力检测试剂盒、MDA、SOD、GSH-Px、CAT检测试剂盒(南京建成生物工程公司)； Hoechst33258染色液(碧云天生物技术研究所)；HSP70、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体和兔抗羊、羊抗兔IgG-HRP分别购自Santa Cruze公司和Jackson ImmunoResearch公司；Easy See Western Blot Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2 SCs的培养、热应激处理及分组 复苏已鉴定冻存的原代SCs[5]，用含13%FBS的DMEM/F-12培养基在34 ℃含5%CO2的饱和湿度条件下培养，在细胞覆盖率达80%～90%时传代，传到三代时用于试验。将细胞分为34 ℃对照(Ⅰ)组；34 ℃+Pue(Ⅱ)组；42 ℃热应激(Ⅲ)组；添加葛根素(IV)组。IV组细胞分别在添加葛根素和维生素E培养24 h后，42 ℃热应激1 h，然后34 ℃恢复6 h。

1.3 葛根素和维生素E最佳浓度的筛选 SCs细胞1×104/孔接种于96孔培养板，培养24 h，将细胞分为空白组、药物组(葛根素5，10，15，20，30，35 μmol/L和40 μmol/L；维生素E 20，25，40，60，80 μmol/L和100 μmol/L)及本底组。在34 ℃下培养24 h，用CCK-8法检测细胞活力，严格按照说明书操作酶标仪450 nm测吸光值。细胞存活率(T/C﹪)=(药物组OD-本底对照组OD)/(空白对照组OD-本底对照组OD)×100%。

1.4 葛根素对热应激后SCs存活率的影响 含葛根素(0，15，20，40，60，80，100 μmol/L)的培养基培养细胞24 h后，用42 ℃热应激1 h，然后恢复培养6 h，最后用CCK-8检测细胞存活率(方法同1.3)。

1.5 Hoechst33258荧光染色检测SCs核凋亡 制作细胞爬片后，将细胞热应激处理，用4%多聚甲醛室温固定，再用Hoechst33258染液在37 ℃避光条件下染色10 min，冲洗后加抗荧光淬灭剂，盖片后用荧光显微镜下观察细胞核。1.6 MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的检测 用0.25%胰酶消化各处理组细胞并取细胞沉淀，超声破碎后，按照相应试剂盒说明检测MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性。

1.7 SCs中HSP70蛋白表达的检测 用Western-Blot检测HSP70蛋白表达，实验步骤参照国晓瞳等进行操作[5]。

2 结果与分析

2.1 热应激诱导SCs凋亡 荧光显微镜观察发现，42 ℃热应激组细胞核由于浓集而呈亮蓝色，细胞核形态不规则，有破碎(图1，A)；而正常组细胞核呈圆形、淡蓝色，形态正常，内有较深蓝色颗粒(图1，B)。在相同荧光强度下，42 ℃热应激组细胞荧光强度高于正常组。

图1 Hoechst33258荧光染色显示热应激组(A)和对照组(B)

2.2 葛根素和维生素E浓度对SCs活力的影响 葛根素浓度在0～15 μmol/L时，细胞存活率均比空白组增加，而随着葛根素浓度增加，细胞存活率逐渐下降(图2，A)。维生素E浓度在0～25 μmol/L间与空白组相比，细胞存活率上升，但随着浓度增加，细胞存活率逐渐下降(图2，B)。因此本试验分别选择15 μmol/L(Pue)和25 μmol/L(维生素E)作为后续细胞处理浓度。

图2 不同浓度的葛根素(A)及维生素E(B)处理对SCs存活率的影响

2.3 葛根素对SCs存活率的影响 受热应激后，SCs存活率(80.67%)极显著(P<0.01)下降(图3)，当葛根素浓度为15 μmol/L时，细胞存活率增加，细胞存活率为90.97%。随葛根素浓度增加(20-100 μmol/L)，细胞存活率逐渐降低。

图3 不同浓度葛根素预处理对热应激SCs存活率的影响

2.4 葛根素对SCs内MDA含量及SOD、GSH-PX和CAT活力的影响 结果如表1所示，与34 ℃对照组相比，42 ℃热应激组细胞(P<0.01)和42 ℃+Pue组细胞(P<0.05)内MDA含量均显著升高；与 42 ℃ 热应激组相比，42 ℃+Pue组和42 ℃+维生素E组细胞MDA含量均极显著(P<0.01)降低；42 ℃+Pue和+维生素E组之间无显著差异(P>0.05)。与34 ℃对照组相比，42 ℃热应激组细胞SOD、GSH-Px和CAT活力均极显著降低(P<0.01)；与42 ℃对照组相比，42 ℃+Pue组和42 ℃+维生素E组细胞内上述指标则显著升高(P<0.05)；42 ℃+Pue组和42 ℃+维生素E组细胞间则无显著差异(P>0.05)。

表1 葛根素对牛睾丸支持细胞MDA含量及SOD、GSH-Px和CAT活性的影响

注：同列数据相比，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，大写字母相同，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大小写字母都相同表示差异不显著(P>0.05)

2.5 葛根素对SCs中HSP70蛋白表达的影响 与34 ℃对照组相比，42 ℃组以及42 ℃+Pue组HSP70蛋白表达极显著增加(P<0.01)；与42 ℃热应激组相比，42℃+Pue组HSP70蛋白表达也显著(P<0.05)增加(图4)。

图4 葛根素对SCs中HSP70蛋白表达的影响

3 讨论

机体内自由基不断产生并不断被清除，一旦出现应激源，机体可产生大量的自由基[6]。研究发现，热应激可使猪睾丸细胞产生活性氧(ROS)，并使生殖细胞脂质发生过氧化反应[2]，当过氧化反应超过抗氧化能力，则诱导产生氧化应激，产生脂类过氧化物，尤其是丙二醛，其过多产生会影响精子运动能力和受精能力[7]。生物体内主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶。本研究发现热应激后SCs细胞存活率显著降低，这可能与MDA含量增加以及细胞凋亡有关，SCs细胞受热应激后，细胞核皱缩浓染，凋亡率增加，同时抗氧化酶含量降低，说明热应激使牛睾丸支持细胞产生氧化应激损伤。

近年来研究葛根素具有较强的抗氧化作用，可降低细胞脂质过氧化作用。提高细胞清除超氧阴离子的能力，从而发挥抗自由基损伤的作用[8]。葛根素可以增强心室乳头肌内SOD活性，降低MDA含量，通过清除自由基减轻脂质过氧化反应，起到保护细胞作用[9]。此外，HSP70是细胞受到应激后产生的蛋白质，具有抗氧化，对过氧化氢所致乳鼠心肌细胞核仁损伤具有保护作用[10]。研究发现，心肌缺血再灌注后葛根素能够显著上调HSP70表达，抑制血清中过氧化物酶(MPO)活性，保护心肌。本研究表明一定浓度葛根素可显著提高热应激细胞后SOD、GSH-Px和CAT活力，极显著降低MDA含量，且与维生素E具有同样的抗氧化效果。同时葛根素提高热应激处理SCs的HSP70蛋白表达，可以推断葛根素对SCs的抗氧化损伤能力可能与HSP70的分子伴侣作用有关。

综上所述，热应激能使牛睾丸支持细胞产生氧化损伤，而葛根素可以有效缓解热应激所致的氧化应激损伤，且其作用机制与葛根素能增加热应激状态下细胞抗氧化酶活性以及增加HSP70的表达有关。然而，葛根素的抗氧化作用机制以及在体内葛根素是否有和在体外同样的作用，还有待进一步深入研究。

[1] Hara T, Tamura K, de Miguel M P,etal. Distinct roles of oncostatin M and leukemia inhibitory factor in the development of primordial germ cells and sertoli cells in mice[J]. Dev Biol. 1998, 201(2): 144-153.

[2] 张晓峰，刘迪，王淼，等. 热应激对猪睾丸细胞活性氧水平影响[J]. 中国农业科学，2009，42(11): 4064-4068.

[3] Arnaud C, Joyeux M, Garrel C,etal. Free-radical production triggered by hyperthermia contributes to heat stress-induced cardioprotection in isolated rat hearts[J]. Br J Pharmacol，2002, 135(7): 1776-1782.

[4] 李宁，郝志梅，崔书霞，等. 葛根素对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国中医基础医学杂志，2014(11): 1501-1503.

[5] 国晓瞳，张倩，于枫，等. 黄芩苷对热应激犊牛睾丸支持细胞胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)和干细胞因子(SCF)表达的影响[J]. 农业生物技术学报，2015(04): 441-449.

[6] 郭洪香. 热应激对小鼠睾丸的损伤及菟丝子提取物对其保护作用的研究[D]. 长沙：湖南农业大学, 2013.

[7] 龚琴琴，张昌军. 活性氧与精子DNA损伤的保护[J]. 中国性科学，2012(04): 3-6.

[8] 吴艳，万华印. 葛根素抗培养脑细胞缺氧-再给氧损伤作用[J]. 中国药理学通报,2003(12): 1437-1438.

[9] 朱庆磊，何爱霞，吕欣然. 葛根素对氧自由基的清除和抗氧化性损伤作用[J]. 解放军药学学报，2001，27(01): 1-3.

[10] 王慷慨，邓恭华，肖卫民，等. 热休克蛋白70对过氧化氢所致乳鼠心肌细胞核仁损伤的保护作用[J]. 中国动脉硬化杂志，2002(05): 384-388.

Protective Effect of Puerarin on Heat Stress-inducedOxidative Damage in Bovine Sertoli Cells

CONG Xia1, ZHANG Dong-jun2, REN Ting-ting1, ZHANG Qian1, ZHU Li-ping1, LI Qi1,CAO Rong-feng1, TIAN Wen-ru1, LI Hua-tao1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng 271600, China)

Puerarin(Pue)is a flavonoid extracted from traditional Chinese medicine Puerarin with obvious antioxidant effect. Whether Pue has the protective effect of Bovine Sertoil cells (SCs) on heat stress is still unclear. The cells were incubated with or without various concentrations of Pue, and then heat-stressed at 42℃ for 1 h and returned to 34℃ for 6h. Cell viability was decreased, and the apoptosis rate was increased and the cellular oxidative damage occurred after heat stress. However, the MDA content in the SCs treated with heat stress decreased significantly after Pue pretreatment.Also, the SOD, CAT and GSH-Px activities were significantly increased compared to heat stress group. There was no significant difference in the parameters determined above between Pue and VE pretreatment groups. Furthermore, Western-blot results showed that Pue significantly enhanced the expression of HSP70. Pue protects SCs from heat stress induced oxidative damage possibly by increasing activities of antioxidative enzymes and increased HSP70 expression.

Bovine Sertoli Cells; Puerarin; Heat stress; HSP70; Antioxidant enzyme activity

LI Hua-tao

2015-08-03

国家自然科学基金 (31572590, 31502138)；山东省自然科学基金(BS2015NY001)；山东省高等学校科技计划项目(J15LF03)

丛霞(1962- )，女，高级实验师,硕士，主要从事动物生殖与生殖疾病研究，E-mail: wrtian@126.com

李华涛，E-mail: htli1986@hotmail.com

R285

A

0529-6005(2016)11-0043-03