水貂源乳酸菌的分离鉴定及其抑菌性研究

任谓明 ， 孙 铭 ， 林志军 ， 赵 丹

(1． 吉林农业大学农业部参茸产品质量监督检验测试中心吉林长春130118 ； 2.通化师范学院分院养殖教研室吉林通化134001 ； 3.吉林特研生物技术有限责任公司 吉林长春130118)

水貂源乳酸菌的分离鉴定及其抑菌性研究

任谓明1， 孙 铭2， 林志军3， 赵 丹1

(1． 吉林农业大学农业部参茸产品质量监督检验测试中心吉林长春130118 ； 2.通化师范学院分院养殖教研室吉林通化134001 ； 3.吉林特研生物技术有限责任公司 吉林长春130118)

通过革兰染色、 菌落形态观察、 生化分析鉴定、 牛津杯抑菌试验对分离到的1株乳酸菌进行研究。 结果显示， 经16S rDNA序列测定,比对分析该株乳酸菌与鼠李糖乳杆菌、 乳酸乳球菌乳亚种、 唾液乳杆菌、 乳链球菌、 哥伦比亚肠球菌和鼠乳杆菌高度同源。 乳酸菌抑菌试验检测显示， 对大肠杆菌、 沙门菌、 蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑菌效应。 同时该株乳酸菌对水貂肠道上皮细胞有一定的粘附能力。 结果表明， 该株乳酸菌株产生菌能够粘附于水貂肠道上皮细胞上并具有较强的抑菌活性。

水貂 ； 乳酸菌 ； 抑菌性 ； 粘附性

乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类革兰阳性菌，不产生芽孢，过氧化氢酶阴性细菌的总称。乳酸菌是益生菌的重要组成部分，担负着机体多种重要的生理功能，并在肠道内发挥益生功能，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长和发育，是广泛应用的益生菌之一。大多数乳酸菌对外界环境耐受能力差，而作为有效的微生态制剂必须能够有较强的定植于肌体肠道内才能发挥其生物学功能。据报道，细菌的粘附性和细菌表面物理化学特性之间没有直接的相关性，而与细菌表面凝集素和粘附黏液的性质有一定的相关性。乳酸菌粘附不同宿主小肠黏液的差异很大，可能是由于不同物种黏液中细菌凝集素受体的分布不同。同种乳酸菌向不同宿主小肠黏液的粘附具有差异性，说明粘附素的表达具有物种特异性。乳酸菌在肠道内的数量较多，可以分解碳水化合物，产生多种有机酸，因而可提高机体的消化机能，促进营养物质的吸收。本试验的目的就是要筛选适用于水貂生产、具有抗逆性和抑菌特性的水貂源乳酸菌株，研究其生物学特性及抑菌活性，为益生素类制剂的制备提供优良菌种[1-2]。

1 材料与方法

1.1 样品来源与处理 试验用水貂(约7月龄)，购自吉林市左家镇某水貂养殖厂，剖杀后取其肠段并用无菌双蒸水冲洗干净。用无菌刀片轻轻刮取肠道上壁的附着物置于无菌离心管中，迅速置于4℃冰箱备用。

1.3 指示菌菌株 大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌由本研究室提供。

1.4 主要试剂 革兰染色试剂：草酸铵结晶紫染色液、卢氏碘液、番红复染液均为自己配制；DNA提取试剂盒，购自TaKaRa公司；溶菌酶，购自Sigama公司；生化发酵试管和葡葡糖、鼠李糖、纤维二糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖、棉籽糖、麦芽糖、蔗糖、山梨糖、淀粉、血清菊糖、蕈糖发酵微量鉴定生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；30%过氧化氢，购自西陇化工股份有限公司；16S rDNA通用引物，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。细胞培养所用试剂：胎牛血清、MEM细胞培养液、胰蛋白酶等，购自长春沃特思生物有限公司。

1.5 主要仪器 PCR仪：BIO-RAD T100；凝胶成像系统：以色列DNR生物成像系统。

1.6 乳酸菌初筛 将处理好的样品用无菌双蒸水依次按101、102、103、104倍梯度稀释分别涂布于MRS固体平板上,37 ℃厌氧培养48 h，挑取不同形态的菌落进行纯化培养，革兰染色，显微镜检，选择无芽孢的革兰阳性菌[3]。

1.7 16S rDNA鉴定 对初筛所得的菌株进行纯化培养后，提取细菌基因组DNA，采用细菌16S rDNA通用引物(上游引物P1：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物P2：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGAC- TT-3’),以基因组DNA为模板，进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：2×premix Buffer 12.5μL，P1、P2各1μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反应程序：95 ℃ 5min、95 ℃ 30s、55 ℃ 30s、72 ℃ 1.5min，35个循环，72℃ 10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度正确的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。从GenBank中获取与之有同源性的菌株序列，采用MEGA软件进行分析。[4]

1.8 乳酸菌生化试验鉴定 对分离的菌株进行常规生化鉴定，包括过氧化氢酶试验、精氨酸产氨试验、葡萄糖产酸产气试验、七叶苷水解试验、石蕊牛奶试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、H2S产生试验、精氨酸水解试验和葡聚糖产生试验。[5]

1.2.1 常规针灸治疗方式 主治医师需要选择患者的肩骼穴位、支沟穴位、肩贞穴位、手五里穴位、手三里穴位、肩井穴位为常规针灸治疗的穴位，并以每天一次的频率为患者进行针灸治疗，共计治疗四周[1-3]。

1.9 菌株糖发酵鉴定 取生化管于距离内容物上方，用砂条割开，迅速于酒精灯火焰消毒，然后用接种针分别挑取少量分离菌株的培养物接种于各种糖发酵微量鉴定生化管中，37℃培养24 h[6]。

1.10 抑菌试验

1.10.1 乳酸菌发酵上清液抑菌试验 以105CFU/mL大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌为指示菌株，采用牛津杯法测定抑菌圈的大小。

1.10.2 乳酸排除试验 将培养24 h的乳酸菌发酵液离心后取上清，用乳酸调节至pH值5.0后，进行抑菌试验，指示菌株为大肠杆菌，采用牛津杯法测定抑菌圈大小[7]。

1.10.3 过氧化氢排除试验 培养液上清按10g/L的量加入过氧化氢酶，37 ℃温育1 h后进行试验，以未加酶的乳酸菌发酵上清液作为对照，指示菌株为大肠杆菌，采用牛津杯法测定抑菌圈大小[8]。

1.11 乳酸菌粘附试验 无菌操作，取水貂小肠黏膜，制成肠上皮细胞悬液。用细胞计数器调整至浓度为50万个/mL的细胞悬液，每50 mL细胞培养瓶中分装5 mL，37 ℃培养24 h。将菌液，经4 000 r/min离心20 min，弃上清。菌泥用PBS洗3次，用营养液配制成浓度为106个/mL的菌液。取该菌液1 mL。加入细胞培养瓶中，培养2 h，其间振摇3次。将细胞一细菌混合培养液，进行500 r/min离心5 min．弃上清。沉淀用PBS洗6遍。取沉淀涂片，革兰染色，镜检[9-10]。

2 结果

2.1 形态特征 利用涂板划线分离技术，挑取菌落形态、颜色均不相同的细菌，经过连续分离纯化最终获得1株乳酸菌并命名为ZJ株。经革兰染色鉴定，该株乳酸菌为革兰阳性菌，单个菌体呈杆状，菌落形态湿润，有光泽，光滑，边缘整齐。

2.2 16S rDNA序列分析 将初筛到的乳酸菌扩大培养后，提取基因组后，扩增细菌的16S rDNA保守序列，经琼脂糖凝胶电泳检测发现该菌株的保守序列约为1 500 bp。如图1。

图1 来源于水貂肠道乳酸菌株的16S rDNA扩增产物

1:ZJ株16S rDNA扩增产物； M:为DL-2 000 DNA Marker

2.3 菌株16S rDNA基因系统发育分析 将扩增得到的乳酸菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中的的数据进行对比发现，ZJ株与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)的16S rDNA的相似性达98%；与乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcuslactissubsp.Lactis)的16S rDNA相似性达99%；与唾液乳杆菌(Lactobacillussalicarius)的16S rDNA相似性达99%；ZJ株与乳酸链球菌(Streptococcuslactis)16S rDNA相似性达99%；与哥伦比亚肠球菌(Enterococcuscolumbae)的16S rDNA相似性达98%；与鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)的16S rDNA相似性达98%。

2.4 乳酸菌的生理生化特性 分离的革兰阳性菌的过氧化氢酶接触反应试验、产H2S试验、明胶液化试验和产气试验均为阴性，且表现为无运动性。石蕊牛奶试验、产酸试验、葡聚糖产生试验、精氨酸水解试验和V-P试验结果显示菌株为阳性。

2.5 乳酸菌的糖发酵鉴定 由糖发酵鉴定结果可知，乳酸菌ZJ株能够发酵葡萄糖、鼠李糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、山梨糖、淀粉、血清菊糖和蕈糖，不能发酵棉籽糖，见表1。

表1 乳酸菌发酵试验

+：阳性，-：阴性

2.6 乳酸菌产生的抑菌效果的本质 ZJ株乳酸菌培养物上清抑菌效果见表3。由表3可知，该乳酸菌对指示菌株显示了抗菌活性，该株乳酸菌对大肠杆菌的抑菌能力相对较弱，对沙门菌和金黄色葡萄球菌显示了较强的抑菌活性。

表3 乳酸菌上清抑菌活性

在乳酸排除试验中试验组的抑菌圈直径要明显大于对照组，说明在ZJ株乳酸菌上清液中，其抑菌作用的成分为有机酸或者依赖有机酸发挥作用的其他物质，乳酸可能起了主要作用。用过氧化氢酶处理的试验组的抑菌圈直径与对照组的结果差别不大认为没有影响，见表4。

表4 不同处理对乳酸菌上清液抑菌活性的影响

2.7 乳酸菌粘附细胞的试验 乳酸菌粘附水貂肠道上皮细胞的结果见图2。由图2可知，ZJ株乳酸菌对水貂肠道上皮细胞有一定的粘附能力。

图2 ZJ株粘附水貂肠道上皮细胞

3 讨论

随着水貂价格的增长,人们在高利润的驱使下,养殖量和养殖密度不断增加,导致疾病不断发生。本研究从水貂本身出发，研究水貂肠道中的益生菌，使水貂健康水平得到提高，从而提高水貂的抗病性。本研究从水貂肠道环境中分离得到1株乳酸菌株ZJ株，并对其生理生化特性进行研究，希望能够获得特征优良、能够作为水貂专用肠道益生菌株的乳酸菌株。

乳酸菌作为一种有效的益生菌，在畜牧生产中应用较广，因此分离鉴定出具有独特优势的乳酸菌极其重要。在应用研究中，表型特征测定一直是鉴定乳酸菌的重要依据，包括形态学和生理学特征的鉴定，主要依据为细菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性和代谢产物等。但传统的细菌鉴定方法试验周期长，工作量大且较为依赖于主观判断。近年来，16S rDNA序列分析比对直接从核酸水平鉴定乳酸菌的方法，能更准确的鉴定分离菌的性质。通过16S rDNA技术，对分离到的乳酸菌ZJ株进行鉴定，结果显示，乳酸菌ZJ株保守序列约为1 500 bp；同时运用理化试验和糖发酵试验研究其特性；乳酸菌ZJ株能够发酵葡萄糖、鼠李糖等多种糖类，不能发酵棉籽糖。研究表明，乳酸菌ZJ株其基因的保守序列与多种优良乳酸菌株都有极高的同源性；且能发酵多种糖类，满足了益生菌株对生理生化方面特性的需要。

乳酸菌作为天然抗生素具有在机体内不残留、不产生耐药和抗药性，同时还可以抑制胃肠道内有害微生物的生长，保护机体的微生态平衡的特点。国内外有很多研究人员对乳酸菌的抑菌活性进行了研究。能够影响乳酸菌抑菌活性的因素主要包括两个方面：一是乳酸菌所分泌的抑菌物质的抑菌作用；另一方面是乳酸菌本身在环境中的定植作用。在本研究中分别对分离到的乳酸菌ZJ株进行了这两方面的试验。结果表明，乳酸菌ZJ株具有一定的抑菌性和对肠道细胞的粘附性，适合作为水貂肠道益生菌的备选菌株。

综上，乳酸菌ZJ株的生理生化特性及粘附性等多方面因素都满足了成为益生菌备选菌株的条件。但其相关机理仍需进一步研究。

[1] Shanmugavelu S,Ruzickova G,Zrustova J,etal.A fermentation assay to evaluate the effectiveness of antimicrobial afents on gut microflora[J].J Microbiol Methods,2006,67(1):93-101.

[2] 尹胜利,杜鉴,徐晨.乳酸菌的研究现状及其应用[J].食品科技,2012,37(9):25-29.

[3] Lutful Kabir S M.The role of probiotics in the poultry industry[J].Int J Mol Sci,2009,10(8):3531-3546.

[4] Fuller R.Probiotics in man and animals[J].J Appl Bacteriol,1989,66(5):365-378.

[5] 任丽,刘国荣,王成涛,等.产细菌素弯曲乳杆菌的分离鉴定及细菌素特性初步研究[J].食品工业科技,2013,34(6):218-223.

[6] Nemcova R.Selecton criteria of Lactobacillus for probiotic use[J].Vet Med,1998,42(1):19-27.

[7] Greene J D,Klaenhammer T R.Factors involved in adherence of Lactobacilli to human Caco-2 cells[J].Appl Environ Microbiol,1994,60(12):4487-4494.

[8] 步卫东,潘裕华,刘彦.鸽小肠黏膜乳酸菌的分离鉴定方法研究[J].中国家禽,2010,32(4):30-33.

[9] 陈世琼,李平兰,张篪.猪源产细菌素乳酸菌的抑菌产物特性研究[J].中国微生态学杂志,2001,13(4):213-215.

[10] Zoetendal E G,Vaughan E E,de vos W M.A microbial world within us[J].Mol Microbiol,2006,59(6):1639-1650.

2016-03-16

吉林农业大学科研启动基金(201334)

任谓明(1983-)，男，助理研究员，硕士，从事微生物与生物技术研究工作，E-mail：469577286@qq.com

赵丹，E-mail：469577286@qq.com

S852

A

0529-6005(2016)11-0046-03