动物RNA病毒检测关键试剂—反转录酶(M-MLV RTase)的制备

牛建蕊 ， 高志强 ， 蒲 静 ， 张 伟， 刘 环 ， 刘文晓 ， 张鹤晓

(1. 北京森康生物技术开发有限公司, 北京怀柔101400 ； 2. 北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026)

动物RNA病毒检测关键试剂—反转录酶(M-MLV RTase)的制备

牛建蕊1， 高志强2， 蒲 静2， 张 伟2， 刘 环2， 刘文晓1， 张鹤晓2

(1. 北京森康生物技术开发有限公司, 北京怀柔101400 ； 2. 北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026)

反转录酶是动物RNA病毒分子诊断用到的关键试剂之一。 为获得纯度高、 活性高、 制备简单经济的M-MLV RTase， 本试验将M-MLV RTase的基因序列进行密码子优化， 合成并构建表达载体。 将表达载体转化到大肠杆菌E.coliRosetta宿主菌种， 经IPTG诱导后实现M-MLV RTase的可溶性表达。 利用Ni2+柱亲和层析纯化载有6xHis标记的重组M-MLV RTase， 对重组酶进行Western Blotting试验， 鉴定为M-MLV RTase。 通过对动物流感病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测来评价重组酶的活性并估测其活性单位。 将活性单位相当的重组酶和商品酶进行比较， 结果显示，制备的重组酶活性高， 对不同浓度病毒RNA的检测结果与商品酶相当。 研制的M-MLV RTase可以用于动物RNA病毒的分子诊断。

M-MLV RTase； 表达； 纯化； RT-PCR

动物疫病诊断和检测不外乎两大类方法，一是针对血清中抗体的血清学检测方法，一是针对病原体的病原学检测方法。抗体检测可以评估使用疫苗后的情况，以及判断是否曾经感染过某种动物疫病，病原学检测是确定动物携带病原体直接证据的方法。病原体分离的优点是结果准确，是病原诊断检测的金标方法，缺点是耗时长，需要几天甚至几周才能出结果，而且还伴随生物安全问题，需要一定生物安全级别的实验室才能进行。

随着分子诊断技术的出现，病原学诊断检测技术得到突飞猛进的发展，病原学诊断检测技术已经达到一个新的高度，不再单单依靠病原分离就能对动物疫病做出准确诊断。动物RNA病毒检测目前应用最广的技术为RT-PCR技术、荧光RT-PCR技术、核酸等温扩增技术等，不论哪种分子诊断技术，都用到关键试剂-反转录酶。反转录酶又称依赖RNA 的DNA 聚合酶，常见的反转录酶主要有M-MLV RTase和AMV RTase。由于反转录酶质量参差不齐，不同品牌的反转录酶效果不一，同一品牌的反转录酶不同批次效果也不同，导致组装的试剂盒质量受到影响。

为保证动物RNA病毒的检测质量，保证检测结果的准确性，本研究表达纯化M-MLV RTase，并对其进行活性评价，以便更好地完善动物RNA病毒分子诊断检测，保证研发的试剂盒的质量。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体E.coliRosetta，购自TaKaRa公司；pET-21b，购自Novagen公司。

1.2 主要试剂 商品酶M-MLV RTase，购自Promega公司；Ni-NTA His·Bind树脂，购自美国QIAGEN；抗His标签单抗，购自Novagen公司和Thermo公司；离心超滤管，购自 Millipore公司。

1.3 目标序列的优化、合成及表达载体的构建 对从NCBI下载的M-MLV RTase基因序列[1]进行利于其在大肠杆菌中可溶性表达的密码子优化后，委托深圳华大基因科技服务有限公司合成并连接到pET-21b载体中，获得重组表达载体pET-21b-MMLV-RT，转化到E.coliRosetta，用于表达。

1.4 重组蛋白的可溶性表达 挑取含有pET-21b-MMLV-RT单菌落接种到5 mL含有100 μg/mL Amp的LB液体培养基，37 ℃ 过夜培养获得母液，按照2%接种量接种到500 mL 上述培养基中，37 ℃振荡培养至OD600在0.2～0.8之间，然后根据不同的培养时间、IPTG浓度以及诱导时间等参数进行表达，摸索最佳诱导条件。

1.5 重组蛋白的纯化与鉴定[2-3]

1.5.1 亲和层析 收集诱导表达的重组菌体，超声破碎、离心，将获得可溶性蛋白上清经0.45 μm滤膜过滤。按说明书进行亲和层析纯化，收集流出液、漂洗液及洗脱液。

1.5.2 超滤 使用Amicon Ultra-15 mL离心超滤管对纯化后的蛋白进行超滤，达到浓缩和置换蛋白保存液的目的。

1.5.3 Western Blotting检测 利用抗His的单抗对带有His标签的重组蛋白进行Western Blotting检测，以鉴定重组蛋白表达。

1.6 活性检测 用动物A型流感病毒M基因的一对引物来扩增流感病毒M基因，并将获得的目的片段进行序列比对，通过普通RT-PCR检验制备重组酶的活性。用重组M-MLV RTase取代动物A型流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的反转录酶，通过荧光RT-PCR来检测重组酶的活性。通过对重组酶与商品酶的荧光RT-PCR扩增对比，来估算重组酶的活性单位。

1.7 灵敏度比较 将相当活性的重组M-MLV RTase与商品酶分别对10倍倍比稀释的动物A型流感病毒RNA进行普通RT-PCR与荧光RT-PCR检测，评价重组酶的检测灵敏度。

2 结果

2.1 重组 M-MLV RTase的诱导表达、纯化与鉴定 最终表达菌在OD600为0.5，加入终浓度0.4 mmol/L的 IPTG，25 ℃低温诱导12 h的条件下获得可溶性的重组蛋白，图1箭头为上清表达的目的蛋白。重组蛋白的纯化结果见图2，图中泳道4到7为4次洗脱后收集到目的蛋白。对目的蛋白进行超滤，最终获得10 mL保存在保存缓冲液中的蛋白液，结果见图3。Western Blotting的鉴定结果见图4，出现了大小在75 kD左右的目的条带。

图1 重组蛋白的可溶性诱导表达

图2 重组蛋白的纯化梯度咪唑漂洗

M:Marker; 1:穿过液； 2～3: 20 mmol/L咪唑洗涤液； 4～7:250 mmol/L咪唑洗脱液

图3 重组蛋白的超滤

1:超滤前； 2:超滤后; M:Marker

图4 重组蛋白Western-Blotting鉴定

2.2 重组 M-MLV RTase的RT-PCR活性检测

2.2.1 普通RT-PCR 重组酶及商品酶通过普通RT-PCR均能扩增出目的片段，将目的片段送测，测得序列与模板序列比对均100%同源，说明重组酶具有反转录酶活性。

2.2.2 荧光RT-PCR 中插彩版图5可见，制备的重组酶与商品酶均能获得荧光RT-PCR扩增曲线。为测定重组酶活性单位，以相同量的商品酶作为对照，将倍比稀释后的重组酶进行荧光RT-PCR。结果见中插彩版图6，由于重组酶加入量过高时，会抑制Taq DNA聚合酶的活性[4]，导致扩增曲线低，随着稀释倍数的增加，重组酶的扩增曲线逐渐升高，说明我们未稀释或稀释度所加酶量都可能超过了最佳用量；但当稀释过高时，酶浓度过低，所以扩增曲线下降，Ct值也开始升高。中插彩版图6中1为0.5 μL(200 U/μL)商品酶的扩增曲线，Ct值为20.10；4为0.5 μL 4倍稀释重组酶的PCR扩增曲线，Ct值为20.42，这两个酶的扩增效果相当，由此可知制得重组酶4倍稀释后至少每微升有200 U的酶活，与商品酶活性相当。

2.3 重组M-MLV RTase与商品酶的灵敏度比较 在普通RT-PCR检测中，相当活性单位的重组酶与商品酶均可检测到稀释到10-4的动物A型流感病毒RNA，但重组酶扩增条带的亮度略高；在荧光RT-PCR检测中，相当活性单位的重组酶和商品酶均可检测到10-6稀释度的病毒RNA，但重组酶的扩增曲线要高于商品酶，结果见中插彩版图7。

3 讨论

已有报道重组M-MLV RTase在大肠杆菌的表达，但表达量低、纯化步骤复杂[5-6-7]。针对上述问题，我们首先通过对目标序列密码子优化和诱导条件摸索解决了可溶性表达量低的问题。再利用重组蛋白上的His标签进行纯化，通过超滤浓缩，减少酶活性的损失，解决纯化复杂，酶活性降低的问题。试验表明，本研究构建的重组表达载体可溶性表达量高、易纯化。

通过对动物病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测，验证了重组M-MLV RTase的反转录活性。荧光RT-PCR试验发现重组酶浓度过高时，会出现抑制反应的现象，在普通RT-PCR检测中不明显，说明制得的酶浓度高。为获得相同活性单位的重组酶进行下游比较试验，我们对重组酶进行倍比稀释后与商品酶对比估测重组酶的活性单位，经过反复试验制得活性单位为200 U/μL的重组酶。将活性单位相同的重组酶与商品酶对不同稀释倍数的动物A型流感病毒RNA进行检测，评价重组酶的灵敏度，结果显示，重组酶与商品酶的灵敏度相当，对低浓度的病毒RNA均可检出。

动物RNA病毒分子诊断及检测的关键试剂-反转录酶的质量是影响结果准确性的关键因素。目前市场销售的商品酶，价格高，保质期短，不能满足动物疫病病原荧光RT-PCR检测试剂盒的需求，因为为了解决这一技术难题，我们进行了反转录酶的制备技术研究，结果显示，本制备技术操作简单、耗时短、产量高，获得的重组酶活性高、灵敏度高、稳定性好，可用于动物病原分子诊断，适于大量推广。

[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M,etal. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J].Structure， 1995，3：879-892．

[2] Mirza M R, Rainer M, Messner C B,etal. A new type of metal chelate affinity chromatography using trivalent lanthanide ions for phosphopeptide enrichment[J]. Analyst，2013，138：2995-3004．

[3] Petty K J. Metal-chelate affinity chromatography[J]. Curr Protoc Protein Sci，2001，Chapter 9：4-9．

[4] Sellner L N, Coelen R J, Mackenzie J S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity[J]. Nucleic Acids Res，1992，20：1487-1490．

[5] Kotewicz M L, D'Alessio J M, Driftmier K M,etal.Cloning and overexpression of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase in Escherichia coli[J].Gene，1985，35：249-258．

[6] Sun D, Jessen S, Liu C,etal. Cloning, expression, and purification of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: crystallization of nucleic acid complexes[J]. Protein Sci，1998，7(7)：1575-1582．

[7] Chen Y, Xu W, Sun Q. A novel and simple method for high-level production of reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus (MMLV-RT) in Escherichia coli[J]. Biotechnol Lett，2009，31(7)：1051-1057．

Preparations of the M-MLV RTase as the key reagent for the detection of animal RNA viruses

NIU Jian-rui1, GAO Zhi-qiang2, PU Jing2, ZHANG Wei2, LIU Huan2, LIU Wen-xiao1, ZHANG He-xiao2

(1. Beijing Senkang Biotech Development Co., Ltd, Beijing 101400, China；2. Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026， China)

Reverse Transcriptase was used as one of the key reagents for Animal RNA virus molecular diagnosis. In order to obtain high purity, high activity, economy and easy preparation of M-MLV RTase, the codons of the sequence of M-MLV RTase were optimized, and the expression vector was constructed and transformed into E.coli Rosetta which was induced by IPTG. Soluble M-MLV RTase expression was achieved, and the M-MLV RTase with a tag of 6 x His was purified by Ni2+affinity chromatograph and identified through Western blotting. The activity and activity unit of the recombinant enzyme were evaluated through the detection of animal influenza virus by ordinary RT-PCR and real time RT-PCR. Compared to commercial Enzyme, the recombinant M-MLV RTase has the same efficasy in testing the influenza virus in different dilutions. The recombinant M-MLV RTase can be used in the diagnosis of animal RNA viruses.

M-MLV RTase; expression; purification; RT-PCR

ZHANG He-xiao

2015-11-12

国家质检总局科技计划项目(2014IK232)

牛建蕊(1983- )，女，博士，主要从事动物疫病检测技术研究，E-mail：jrniu@126.com

张鹤晓，E-mail:aqlzhx@126.com

S852.65+93

A

0529-6005(2016)11-0026-03