福建省蛋鸭主要细菌感染检测及其生物学特性测定与分析

傅秋玲 ， 程龙飞 ， 傅光华 ， 刘荣昌 ， 万春和 ， 施少华 ， 陈红梅 ， 陈 珍 ， 陈翠腾 ， 黄 瑜

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室， 福建福州350013)

福建省蛋鸭主要细菌感染检测及其生物学特性测定与分析

傅秋玲 ， 程龙飞 ， 傅光华 ， 刘荣昌 ， 万春和 ， 施少华 ， 陈红梅 ， 陈 珍 ， 陈翠腾 ， 黄 瑜

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室， 福建福州350013)

为明确福建省蛋鸭(金定鸭、山麻鸭、连城白鸭)流行的主要细菌病及其生物学特性，采用PCR方法对2013年以来福建省及周边省(区)临床调查采集和送检的病死或表现产蛋下降的852份以上3种蛋鸭样品进行了禽多杀性巴氏杆菌、致病性鸭大肠杆菌、鸭疫里默菌和禽沙门菌感染的病原学检测，并对阳性样品进行细菌分离鉴定及其生物学特性研究。结果表明,金定鸭、山麻鸭与连城白鸭样品中以上4种细菌感染的阳性率分别为8.6%、18.2%、5.3%、1.4%，10.4%、21.8%、4.2%、1.7%和8.8%、17.6%、3.8%、0%，其中鸭大肠杆菌病、禽霍乱是危害以上3种蛋鸭养殖的主要细菌病。经血清型鉴定表明，以上4种致病菌的主要血清型(抗原群)分别为荚膜A型，O78、O2、O88为2型、11型和肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌为主；经长期药敏试验监测表明，对4种致病菌的首选敏感药物分别有5种、2种、7种和10种，可见对致病性大肠杆菌敏感的药物少、其耐药谱最广。

蛋鸭 ； 主要细菌病 ； 血清型 ； 耐药性

我国为世界水禽生产大国，据不完全统计，2015年我国鸭饲养量达52亿只，约占世界鸭总量的75%以上，对我国的禽肉生产、肉蛋结构调整、农村脱贫致富及改善人民生活等方面发挥了重要作用。而我国对鸭养殖、疫病防控等相关研究更多聚焦于肉鸭[1]。随着人民生活水平的提高，大家对鸭蛋的需求量也日渐增多，对蛋品的要求也越来越高。然而，沙门菌和大肠杆菌而引发的鸭蛋食源性食品安全事件也不断发生，再加上抗生素的残留问题，蛋品的卫生安全日益引起大众的密切关注[1-5]。

为此，只有提高蛋鸭的健康养殖水平，减少蛋中致病菌的感染与携带，才能从源头提高蛋品质量。而疫病防控又是蛋鸭健康养殖的关键环节，因此,我们对2013年以来自福建省及周边省(区)临床调查采集和送检的病死或表现产蛋下降的金定鸭、山麻鸭、连城白鸭3种蛋鸭样品进行了禽霍乱、鸭大肠杆菌病、鸭传染性浆膜炎和禽沙门菌感染的病原学检测，并对阳性样品开展细菌分离鉴定及其血清型鉴定和敏感药物筛选，为福建省蛋鸭(金定鸭、山麻鸭、连城白鸭)细菌病的临床防治提供科学依据和技术支撑，也为生产健康无药物残留的绿色鸭蛋提高其食品安全发挥作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与药敏纸片 DNA抽提试剂盒、DNA琼脂胶回收试剂盒，购自QIAGEN科技有限公司；DNA聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 样品的来源及处理 2013年以来，自福建、江西、广东、广西、江苏、浙江6个不同省(区)蛋鸭场采集或送检的病死或表现产蛋下降的金定鸭、山麻鸭、连城白鸭肝脏样品分别为209份、404份和239份，共852份。

1.3 样品的PCR检测 取1mL细菌培养液离心取沉淀以DNA提取试剂盒提取核酸，参照已报道的禽多杀性巴氏杆菌[6,10,12]、致病性大肠杆菌[12-13]、鸭疫里默菌[8,14]、禽沙门菌[15]等PCR方法检测各肝脏样品中4种细菌的感染情况。

1.4 细菌的分离及鉴定 对经PCR检测为阳性的病死或表现产蛋下降鸭的样品，参照已报道的禽多杀性巴氏杆菌[6]、致病性大肠杆菌[7]、鸭疫里默菌[8]、禽沙门菌[9]等培养方法分离培养细菌，挑取单个疑似阳性菌落接种于细菌培养液中，取培养液进行革兰染色、镜检及其PCR鉴定。

1.5 药敏试验 采用药敏纸片检测阳性菌对常用抗生素的敏感性，按中国食品药品检定研究院制定的《抗菌药物药敏试验判断标准》进行判定，测定对阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素、丁胺卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、氟哌酸、复方新诺明、红霉素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、磺胺甲基异恶唑、庆大霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、壮观霉素、大观霉素、新霉素、泰乐菌素、四环素、林可霉素和克林霉素等抗生素的敏感程度。

1.6 血清型(抗原群)鉴定 参照已报道的禽多杀性巴氏杆菌[6]、致病性大肠杆菌[7]、鸭疫里默菌[8]、禽沙门菌[17]等血清型(抗原群)鉴定方法，对阳性菌进行血清型或抗原群鉴定。

2 结果

2.1 3种蛋鸭细菌感染的检测结果 自2013年以来，以建立的PCR方法对从福建、江西、浙江、广东、广西和江苏6个不同省(区)蛋鸭场采集或送检的金定鸭、山麻鸭、连城白鸭样品共852份进行对禽多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、鸭疫里默菌和沙门菌感染的检测，其中金定鸭样品中4种细菌感染的阳性率分别为8.6%(18/209)、18.2%(38/209)、5.3%(11/209)、1.4%(3/209)；山麻鸭样品中其阳性率分别为10.4%(42/404)、21.8%(88/404)、4.2%(17/404)、1.7%(7/404)；连城白鸭样品中其阳性率分别为8.8%(21/239)、17.6%(42/239)、3.8%(9/239)、0%(见图1)。可见，3个品种蛋鸭均以致病性大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌感染的阳性率更高。

图1 蛋鸭主要细菌病感染检测结果

2.2 不同年份蛋鸭细菌感染的检测结果 自2013年以来，以上6个省(区)不同年份3个品种蛋鸭感染细菌的阳性率存在差异。以福建省为例，2013—2016年期间福建省3个品种蛋鸭样品检测以上4种细菌感染的阳性率分别为36.3%、29.5%、33.6%和31.8%，因此，以2013年感染的阳性率最高为36.3%，2014年感染的阳性率最低为29.5%。

2.3 不同省(区)蛋鸭细菌感染的检测结果 对从福建、江西等6个省(区)采集或送检的引起产蛋下降或病死的3个品种蛋鸭样品进行禽多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、鸭疫里默菌和沙门菌感染的检测，除连城白鸭样品沙门菌感染率为0%外，其余均检出阳性，只是阳性感染率高低不同而己，其中以江西省的3种蛋鸭感染4种细菌的阳性率最高达43.7%(详见表1)。

表1 2013—2016年不同省(区)蛋鸭样品感染细菌的检测

2.4 细菌分离 对经PCR检测为阳性的病死或表现产蛋下降鸭的样品进行以上细菌的分离培养与鉴定，结果获得禽多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、鸭疫里默菌和沙门菌菌株数分别为54、119、24、6株，其分离率分别为66.7%、70.8%、64.9%和60%，其中以致病性大肠杆菌的分离率最高、沙门菌的分离率最低(见表2)。

表2 阳性样品的细菌分离

2.5 血清(抗原)型鉴定 对已分离鉴定的4种细菌分别进行血清型测定，结果54株中禽多杀性巴氏杆菌的荚膜血清群均为A型；119株致病性大肠杆菌中，除3株自凝、5株未能定型，其余菌株分属于9个血清型，其中O78血清型菌株53株，占44.54%，结果表明，致病性大肠杆菌主要血清型为O78、O2和O88；24株鸭疫里默菌血清型包括1、2、11、13、14和17等血清型，其中最多的是2型(11株，占45.8%)，其次为11型(4株，占16.7%)、1型(3株，占12.5%)和17型(2株，占8.3%)，这4种血清型合计占所有菌株的83.3%，其中又以2型和11型最为常见；6株沙门菌以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主。

2.6 药敏试验 对已分离的4种细菌分别进行药敏试验，80%以上菌株禽多杀性巴氏杆菌的敏感药物为氨苄青霉素、复方新诺明、头孢唑啉、多黏菌素B和强力霉素，共5种；119株致病性大肠杆菌中，全部菌株对多黏菌素B和红霉素耐药，80%以上的菌株对氟哌酸、复方新诺明、磺胺甲基异恶唑、庆大霉素、泰乐菌素耐药，敏感药物仅有头孢唑啉和氟苯尼考2种；37株鸭疫里默菌中80%以上菌株对丁胺卡那霉素、氨苄青霉素、头孢拉定、头孢氨苄、头孢唑啉、壮观霉素和氟苯尼考等7种药物敏感；6株沙门菌的敏感药物较多，共有氨苄青霉素、丁胺卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、氟哌酸、复方新诺明、链霉素、强力霉素、头孢唑啉和大观霉素共10种。

3 讨论与分析

3.1 自2013年以来，以建立的PCR方法对从福建、江西、广东、广西、江苏、浙江6省(区)蛋鸭场采集或送检的金定鸭、山麻鸭、连城白鸭样品共852份分别进行禽多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、鸭疫里默菌和沙门菌感染阳性率表明，福建省的3个品种蛋鸭(金定鸭、山麻鸭和连城白鸭)存在较严重的细菌感染，主要为大肠杆菌病和禽霍乱，且以山麻鸭的阳性感染率更高，揭示山麻鸭的养殖条件有待改善。

3.2 对6省(区)引起产蛋下降或死亡的蛋鸭样品进行禽多杀性巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、鸭疫里默菌和沙门菌感染检测，均检出阳性，阳性率为31.4%-43.7%，其中以江西省的蛋鸭样品阳性检出率最高，表明江西省蛋鸭的养殖条件相对较差，有待改进。

3.3 结合细菌的药敏试验结果，近期防治禽霍乱的首选药物为氨苄青霉素、复方新诺明、头孢唑啉、多黏菌素B和强力霉素5种，防治鸭传染性浆膜炎敏感药物共有7种，主要为丁胺卡那霉素、氨苄青霉素、头孢唑啉和氟苯尼考等，防治禽沙门菌病的敏感药物共有10种，主要为丁胺卡那霉素、氟哌酸、复方新诺明等，而致病性大肠杆菌的耐药谱较广，只有头孢唑啉和氟苯尼考两种药物可供选用。自不同样品中分离的同一种细菌，其药敏结果差异较大、耐药谱宽窄不一，这与每个饲养场的用药情况直接相关。因此，针对不同养殖场实际用药时，需结合对每个场每次发病的细菌分离及药敏试验结果指导用药，且每次用药尽量不要重复，以免产生耐药情况。

3.4 经血清型试验鉴定结果发现，禽多杀性巴氏杆菌的荚膜血清群为A型，致病性大肠杆菌的血清型主要为O78、O2和O88，鸭疫里默菌的血清型主要为2型和11型，沙门菌以肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌为主，为以上4种主要细菌病疫苗研发血清型(群)的选择提供科学依据，也为生产中防控这4种主要细菌病的疫苗选择提供参考。

[1] 毛雪丹, 胡俊峰, 刘秀梅. 2003—2007年中国1060起细菌性食源性疾病流行病学特征分析[J]. 中国食品卫生杂志, 2010, 22(03):224-228.

[2] 陈艳, 郭云昌, 王竹天,等. 2006年中国食源性疾病暴发的监测资料分析[J]. 卫生研究, 2010, 39(03):331-334.

[3] 曾晓芳. 畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制[J]. 四川畜牧兽医, 2003, 30(4):28-29.

[4] 史秋梅, 张艳英, 高桂生,等. 河北省部分地区肉、蛋食品大肠杆菌污染状况的检测[J]. 河北科技师范学院学报, 2012, 26(4):7-11.

[5] 罗赋毅. 出口带壳鸭蛋沙门氏菌控制规范的建立[D].福州：福建农林大学, 2008.

[6] 程龙飞, 许利娜, 林建生,等.福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定[J]. 中国动物传染病学报,2014，22(4)：40-44.

[7] 程龙飞, 陈红梅, 李宋钰, 等. 鸭大肠杆菌强毒株的血清型及生物学特性分析[J]. 中国生物制品学杂志，2011，24:1437-1441.

[8] 程龙飞, 陈红梅, 施少华, 等. 鸭疫里默氏菌的血清型及药物敏感性分析[J]. 中国动物传染病学报，2013，21(4)：23-28.

[9] 王建舫, 何诚, 查振林, 等. 禽源沙门氏菌的血清型分布与耐药性分析[J]. 养禽与禽病防治，2009，8:9-11.

[10] 赵耘, 杜昕波, 李伟杰, 等. 利用菌落多重PCR方法进行不同动物来源多杀性巴氏杆菌鉴定的研究[J]. 中国兽医杂志,2010,46(8):3-6.

[11] 于成接, 丁优玲, 华亚峰, 等. 禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定与致病性研究[J]. 中国兽医杂志, 2013,49(2):21-24.

[12] 金文杰, 郑志明, 王倩倩, 等. 禽源性大肠杆菌HPI irp2基因序列的扩增及比较 [J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2005, 26 (3):5-7.

[13] 朱善元, 陆辉, 王健. 禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测 [J]. 微生物学报, 2007, 47(5):795-799.

[14] 杨建远, 邓舜洲, 何后军. PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究 [J]. 江西农业大学学报, 2005, 27(3): 439-442.

[15] 陈金顶, 索青利, 廖明,等. 沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测[J]. 中国人兽共患病学报, 2004, 20(10):868-871.

[16] Heddleston K L, Gallagher J E, Rebers P A. Fowl Cholera: gel diffusion precipitin test for serotypingPasteurellamultocidafrom avian species[J].AvianDis, 1972, 16(4):925-936.

[17] 张秀英, 赵富华, 宋立,等. 禽源沙门氏菌的血清型鉴定和耐药性研究[J]. 中国家禽, 2007, 29(01):18-19.

Epidemiological Survey and Analysis on main bacteria from Fujian laying ducks

FU Qiu-ling， CHENG Long-fei， FU Guang-hua， LIU Rong-chang， WAN Chun-he，SHI Shao-hua， CHEN Hong-mei， CHEN Zhen， CHEN Cui-teng， HUANG Yu

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center,Fujian provincial key laboratory for avian diseases control and prevention, Fuzhou 350013, China)

To define the characteristics of the main bacteria from Fujian laying ducks including Jinding duck,Shanma duck and Liancheng white duck, 852 samples were collected from laying ducks with irregularity and reduction or death from duck farms of Fujian Province and its periphery during 2010—2013.Pasteurellamultocida,Escherichiacoli,Riemerellaanatipestifer,andsalmonellaswere detected by PCR. The results showed that the rates of the four kinds of bacteria were 8.6%,18.2%，5.3% and 1.4% for Jinding duck， 10.4%, 21.8%, 4.2% and 1.7% for shanma duck and 8.8%、 17.6%、 3.8% and 0 for Liancheng white duck. SoEscherichiacoliandPasteurellamultocidawere the main bacteria which post threat to Fujian laying ducks, The capsular serotype A and O78, O2, O88 and 2, 11 serotypes andSalmonellatyphimuriumorSalmonellatyphimuriumwere the main serotypes of the four kinds of bacteria. Five, two, seven and ten kinds of preferred drugs were used for the four kinds of bacteria. And the resistance profile ofEscherichiacoliwas the widest.

laying duck;bacteria; serotype; resistance

HUANG Yu

2016-08-18

国家水禽产业技术体系建设专项 (CARS-43)；福建省优良蛋鸭品种与设施化养殖创新产业化工程项目(2014-2016)；福建省畜禽疫病防控技术重大研发平台(2014N2003)；福建省属公益类项目(2015R1023—2)；福建省农业科学院“双百”行动项目(sbmx1625)

傅秋玲(1985- )，女，助理研究员，硕士，主要从事水禽疫病研究，E-mail：qiulingfu0822@163.com

黄瑜，E-mail：huangyu_815@163.com

S858.32

A

0529-6005(2016)11-0010-03