超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱法快速测定纸质食品接触材料中的5种异噻唑啉酮类防腐剂

王成云，刘彬彬，尹丽娟，林君峰，沈雅雯

（1.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518067；

2.深圳大学 化学与环境工程学院，广东 深圳 518060）

超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱法快速测定纸质食品接触材料中的5种异噻唑啉酮类防腐剂

王成云1，刘彬彬1，尹丽娟1，林君峰1，沈雅雯2

（1.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518067；

2.深圳大学 化学与环境工程学院，广东 深圳 518060）

建立了一种快速测定纸质食品接触材料中5种异噻唑啉酮类防腐剂的超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC/Orbitrap HRMS）分析方法。该方法以甲醇为萃取溶剂，超声萃取纸质食品接触材料中的异噻唑啉酮类防腐剂，萃取液经浓缩定容后，进行UPLC/Orbitrap HRMS分析。采用Hypersil GOLD色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）对5种异噻唑啉酮类防腐剂进行色谱分离，流动相为甲醇-φ（甲酸）=0.1%水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾正离子（ESI+）模式，一级质谱全扫描范围为m/Z100～300，5种异噻唑啉酮类防腐剂的质量准确度误差均小于2×10-6。利用目标分析物的保留时间和准分子离子的精确质量数进行定性，利用提取离子色谱峰面积进行外标法定量。在0.2～100.0 μg/L范围内，5种异噻唑啉酮类防腐剂的线性相关系数均大于0.998，方法检出限为0.1 μg/kg。在3个不同加标浓度水平下，平均加标回收率为81.8%～94.5%，相对标准偏差为3.6%～9.8%。该方法定性可靠，定量准确，检出限低，可完全满足纸质食品接触材料中异噻唑啉酮类防腐剂检测工作的需要。

超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱；纸质食品接触材料；异噻唑啉酮；超声萃取；快速测定

纸质食品接触材料是一类重要的食品包装材料[1]，品种丰富，且绿色环保，但作为原料的纸为微生物的繁殖提供了良好的环境，易导致纸的质量降低，甚至影响正常生产，企业往往使用防腐剂来控制微生物的生长繁殖[2]。异噻唑啉酮类防腐剂是一类高效广谱杀菌剂，大量用于造纸工业中的杀菌防霉[3-7]。异噻唑啉酮类防腐剂是一类非氧化性杀菌剂，能透过细胞膜和细胞壁进入菌体分子，并与菌体分子内含有巯基的成分发生反应，导致细胞死亡[8]。但是异噻唑啉酮类防腐剂具有一定的细胞毒性和神经毒性，能引起接触性皮炎[9-12]，因此各国纷纷立法限制其使用[13]，限制使用的异噻唑啉酮类防腐剂共有5种：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI）、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮（BIT）、2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OI）和4，5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOI）。纸质食品接触材料在生产加工过程中如果残留有异噻唑啉酮类防腐剂，当其与食品长时间接触时，就会转移至食品中，污染食品，并最终随食品摄入而进入人体，危害人体健康。因此，有必要对纸质食品接触材料中异噻唑啉酮类防腐剂的残留量进行监控。

本文采用超声萃取技术提取纸质食品接触材料中的异噻唑啉酮类防腐剂，提取产物进行超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质量（UPLC/Orbitrap HRMS）分析，从而建立了一种快速测定纸质食品接触材料中异噻唑啉酮类防腐剂含量的液质联用方法，并用于市售产品的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

5210超声波清洗器（美国Bransonic公司）；Dionex Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；0.22 μm滤膜（德国CNW技术公司）；Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司）；氮吹仪（北京康林科技有限责任公司）；SmarVaporRE501旋转蒸发仪（德国Dechem-Tech公司）。

标准品CMI（纯度99.0%），由德国Dr.Ehrenstorfer GbmH公司提供；BIT（纯度99.2%）、MI（纯度100.0%）、OI（纯度 99.9%），均由美国 Sigma-Aldrich公司提供；DCOI（纯度99.8%），由日本东京化成株式会社提供。用甲醇配制混合标准溶液贮备液，其中MI、CMI、BIT、OI和 DCOI的质量浓度分别为 4.844、4.854、4.814、4.858和4.896 μg/mL。使用时，用甲醇逐级稀释成标准溶液工作液。

甲醇（色谱纯），由美国Tedia公司提供；甲酸（纯度98.0%），由德国CNW技术公司提供；分析纯试剂均由广州化学试剂厂提供，实验用水为经Milli-Q纯水系统处理的二级水。

1.2 样品前处理

准确称取1.0 g剪碎后的样品，置于150 mL磨口锥形瓶中，加入20 mL甲醇，温度45℃下超声萃取30 min，过滤，将滤液旋转蒸发至近干，转移至氮吹仪中，用干燥氮气缓慢吹干，用1 mL甲醇溶解残留物，所得溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行UPLC/Orbitrap HRMS分析。必要时，先进行适当稀释。

1.3 阳性样品的制备

ZK1号孔共进行了多次系统测温，终孔时系统测温结果显示，孔内水温由22.9 ℃逐步增加至68.7 ℃(测温段为孔深5～870 m，每5m测量一次)，测温曲线呈“分段线性递增”，见图1，其中孔深70～480 m地温梯度约每100 m 6.15 ℃，孔深480～600 m地温梯度约每100 m 5.12 ℃，孔深600～830 m地温梯度约每100 m 4.61 ℃，孔深830～870 m地温梯度约每100 m 2.5 ℃，全孔地温梯度整体较高，虽然深部830～870 m地温梯度有所降低，该测温段仅有40 m厚，不具有代表性，也有可能往深部地温梯度回升。

将市售纸质食品接触材料剪碎，在混合标准溶液中密闭浸泡24 h，取出后晾干。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱分离在Hypersil GOLD色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）上进行，流速为0.3 mL/min，流动相为甲醇（A）-φ（甲酸）=0.1%水溶液（B），采用梯度洗脱模式，0.00 min时，流动相为40%A/60%B（V/V），1.90 min时，流动相线性递变为90%A/10%B（V/V），该流动相保持至6.00 min，6.01 min时，流动相变为40% A/60%B（V/V），并保持至9.00 min；色谱柱温度为40℃，样品室温度为7℃。

1.4.2 质谱条件

可加热的电喷雾离子源，采用正离子电离（ESI+）模式，喷雾电压为3 500 V，毛细管温度为320℃，辅助气加热温度为350℃；鞘气流速为30 mL/min，辅助气流速为10 mL/min；采用全扫描方式，扫描范围为m/Z100～300；离子提取窗口宽度为5×10-6。表1给出了5种异噻唑啉酮类防腐剂的质谱分析参数。

表1 5种异噻唑啉酮类防腐剂的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 超声萃取条件的优化

通过对市售纸质食品接触材料中的异噻唑啉酮类防腐剂含量的监测，未发现阳性样品，因此以自制的阳性样品来进行萃取条件的优化。

超声萃取效率受萃取温度、萃取时间和萃取溶剂种类及溶剂用量影响，以甲醇为萃取溶剂，分别考虑萃取时间（因素A）、萃取温度（因素B）和萃取溶剂用量（因素C）对超声萃取效率的影响，以5种异噻唑啉酮类防腐剂的总萃取量作为判断萃取效果的依据，结果发现，当萃取时间为30 min、萃取温度为45℃、萃取溶剂体积为20 mL时，总萃取量分别达到最大值。为考虑这3个因素的综合影响，按表2设计进行了正交试验，测定每个条件下各目标化合物的萃取量及总萃取量，并根据总萃取量计算各因素的k值、极差和最优方案。

表2的数据表明，萃取时间（因素A）对总萃取量影响最大，其次是萃取溶剂用量（因素C），萃取温度（因素B）影响最小，确定的优方案为A1B1C1。根据此方案，分别以甲醇、二氯甲烷、乙醇、三氯甲烷、乙腈、叔丁基甲醚、丙酮/二氯甲烷（1∶1，V/V）、丙酮、丙酮/正己烷 （1∶1，V/V）和石油醚等10种常见溶剂为萃取溶剂，对自制阳性样品进行萃取，测定各组分的萃取量，并计算总萃取量，结果见表3。

从表3数据可知，甲醇的萃取效果最好。超声萃取条件最终优化如下：以20 mL甲醇为萃取溶剂，温度45℃下超声萃取30 min。

2.2 分析条件的优化

液质分析时通常使用甲醇/水和乙腈/水2种流动相，分别采用这2种流动相对5种异噻唑啉酮类防腐剂进行分离，结果均能将各组分完全分离，但使用甲醇/水作为流动相时，各组分的信号明显较强，故选择甲醇/水作为流动相。在水中加入一定浓度的甲酸可促进离子化，改善谱峰的形状，并进一步增强信号强度[24]。在水中添加0.05%～1.00%体积分数的甲酸，观察各组分提取离子色谱峰面积的变化，结果发现，当甲酸加入量为0.1%体积分数时，提取离子色谱峰总面积最大。因此，选择甲醇-φ（甲酸）=0.1%水溶液作为流动相。改变流动相的初始组分和洗脱梯度，观察各提取离子色谱峰面积的变化以及各组分间的分离度变化，最终确定的色谱分离条件（见1.4.1）。在此条件下对5种异噻唑啉酮类防腐剂法混合标准溶液进行分析，得到图1所示的总离子流图。

表2 正交试验设计方案及结果和极差分析

表3 不同溶剂的萃取效果 mg/kg

图1 5种异噻唑啉酮类防腐剂的总离子流图

2.3 方法的线性关系和检出限

用甲醇将混合标准贮备液逐级稀释，配制系列混合标准工作液，按上述方法进行测定，用各组分提取离子色谱峰面积对其质量浓度作图，结果表明，5种异噻唑啉酮类防腐剂的提取离子色谱峰面积在一定质量浓度范围内均与其质量浓度线性相关，线性相关系数均大于0.998。表4给出了5种异噻唑啉酮类防腐剂的保留时间（tR）及线性关系。按信噪比（S/N）为3确定各组分的检出限，也列于表4中。

2.4 方法的回收率和精密度

以不含目标分析物的白纸为空白基质，按表5分别添加不同浓度的混合标准溶液，制备3个不同添加浓度水平的加标测试样，每个添加浓度水平均制备9个平行样，按上述方法进行测试，计算方法的平均加标回收率和精密度[以相对标准偏差（RSD）表示]，实验结果见表5。

由表5可见，方法的平均加标回收率为81.8%～94.5%，精密度为3.6%～9.8%。

表4 方法的线性关系和检出限

表5 方法的加标回收率和精密度实验

2.5 实际样品测试

采用本文建立的方法对市售纸质食品接触材料进行测试，测试样品中包括快餐包装纸盒、方便面包装纸盒、纸杯、包装纸袋、快餐纸垫、水果包装纸箱和蛋糕包装纸盒等7类共56个样品，测试结果均小于0.1 μg/kg，低于方法检出限。

3 结束语

建立了一种快速测定纸质食品接触材料中5种异噻唑啉酮类防腐剂含量的分析方法，该方法以甲醇为萃取溶剂，超声萃取纸质食品接触材料中的异噻唑啉酮类防腐剂，萃取液经浓缩定容后进行UPLC/ Orbitrap HRMS分析，外标法定量。该方法分析耗时短，定性可靠，定量准确，灵敏度高，检出限低至0.1 μg/kg，完全满足异噻唑啉酮类防腐剂检测的技术要求，适用于纸质食品接触材料中异噻唑啉酮类防腐剂含量的测定。

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Rapid Determination of Five Isothiazolinone Preservatives in Paper Packaging Materials Intended to Come into Contact with Foodstuffs by UPLC/Orbitrap HRMS

WANG Cheng-yun1，LIU Bin-bin1，YIN Li-juan1，LIN Jun-feng1，SHEN Ya-wen2
（1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518067，China；2.College of Chemistry and Environmental Engineering，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China）

An effective method was established for rapid determination of five isothiazolinone preservatives in paper packaging materials intended to come into contactwith foodstuffs using ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry（UPLC/Orbitrap HRMS）technique.Isothiazolinone preservatives in paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs were ultrasonically extracted by using methanol as the extraction solvent.The extract was concentrated and analyzed by UPLC/Orbitrap HRMS.The chromatographic separation of five isothiazolinone preservatives was performed on a Hypersil GOLD column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）with a gradient elution of methanol and 0.1%（volume）aqueous formic acidsolution.Five isothiazolinone preservatives were detected by orbitrap HRMS in ESI positive mode.Full-scan experiment was performed in the range fromm/Z100 tom/Z300.Five isothiazolinone preservatives were routinely detected with mass accuracy error below 2×10-6.The qualitative analysis was carried out by the retention time and the exact mass of quasi-molecularion.The quantitative analysis was carried out by the peak area external standards in extracted chromatograms.The correlation coefficients（r）were all larger than 0.998，and the limits of detection（LODs）were 0.1 μg/kg for all five isothiazolinons in the range from 0.2 μg/L to 100.0 μg/L.The blank samples were spiked at three different spiked levels and the spiked average recoveries varied from 81.8%to 94.5% while the relative standard deviation（RSD）varied from 3.6%to 9.8%.The proposed method was reliable，accurate and sensitive，and could completely satisfy the demand on the analysis of isothizolinones in paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs.

ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry；paper packaging materials intended to come into contact with foodstuffs；isothiazolinne；ultrasonic extraction；rapid determination

O657.7+2

A

1007-2225（2016）05-0024-06

王成云先生（1969-），博士，研究员；主要从事轻纺产品中有毒有害物质分析；E-mail：wangchengyun 2009@126.com。

2016-08-09（修回）

深圳出入境检验检疫局科技计划项目（SZ2014102）

本文文献格式：王成云，刘彬彬，尹丽娟，等.超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱法快速测定纸质食品接触材料中的5种异噻唑啉酮类防腐剂[J].造纸化学品，2016，28（5）:24-29.