猪圆环病毒2型O R F2基因片段的原核表达

李 裕，邓舜洲，傅胜才，黄 勇，高 华，刘文峰，张文波，陈松昌，万文忠，张 顺

（1.湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006；2.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；3.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410006；4.沅江市畜牧水产局，湖南沅江413100；5.南昌金牧动物保健服务有限公司，江西南昌330013)

猪圆环病毒2型O R F2基因片段的原核表达

李 裕1，邓舜洲2，傅胜才3，黄 勇1，高 华4，刘文峰2，张文波2，陈松昌5，万文忠5，张 顺5

（1.湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006；2.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；3.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410006；4.沅江市畜牧水产局，湖南沅江413100；5.南昌金牧动物保健服务有限公司，江西南昌330013)

猪圆环病毒2型（PC V2）的衣壳蛋白由O R F2编码。采用PC R技术扩增得到O R F2基因片段，克隆入pU C m-T载体，构建了重组质粒pU C m-PC V2-O R F2。根据pU C m-PC V2-O R F2测序结果设计引物，用Pf u酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体pG EX-4T-1，并转化到BL21(D E3)宿主菌，成功构建了G ST-PC V2-O R F2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后，对以包涵体形式存在的G ST-PC V2-O R F2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的G ST-PC V2-O R F2重组蛋白具有良好的反应原性。

PC V2；O R F2；基因；原核表达

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属。根据致病性、抗原性、基因序列的不同，猪圆环病毒分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1和PCV2都广泛存在于全世界的猪群中。PCV1无致病性。PCV2能损伤猪的免疫系统，表现出多种病症。这些病症有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM W S)、皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病复合症(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性皮炎、坏死性淋巴结炎、仔猪先天性震颤。

PCV2基因组开放阅读框2（ORF2）编码的衣壳蛋白具有型特异性[1]，因此ORF2编码的衣壳蛋白是PCV2亚单位疫苗的理想抗原，也是用来检测PCV2抗体水平的理想抗原。本研究尝试利用原核表达载体pGEX-4T-1表达PCV2的ORF2基因片段，期望能得到具有良好抗原活性、较高纯度的PCV2衣壳蛋白。

1 材料

1.1 毒株、质粒与菌株

感染PCV2(JX1株)的PK15细胞由江西农业大学动物科技学院邓舜洲博士惠赠。DH 5α e.col i菌、BL21(DE3)e.col i菌、pGEX-4T-1质粒由江西农业大学动物科技学院张文波博士惠赠。pUCm-T载体购自上海生工生物工程公司。

1.2 主要试剂

Taq酶、Pf u酶购自北京天根生物技术公司。Bam H I限制性内切酶、Xho I限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司。离心柱型质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生物技术公司。DNA快速连接试剂盒购自Prom aga公司。100bp LadderDNA M arker、小分子量蛋白质M arker购自天根生物技术公司。PCV2阳性血清、PCV2阴性血清（SPF猪血清）由江西农业大学动物科技学院邓舜洲博士惠赠。其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 引物

参照genbank已知的PCV2序列,使用Pri m er软件辅助设计两对引物。

引物ORF2-F1：5'-TAG GAT CCT GGA(C)ATT (C)TTC AAC AG(C)C C-3'（25nt）；ORF2-R1：5'-GGC TCG AGT TTA GGG TTA AGT GGG-3'（24nt）。产物为593bp的ORF2片段。引物ORF2-F2：5'-GTG GAT CCC GTA TTC GTA AGG TTA AGG TTG AAT TCT G-3'(37nt)；ORF2-R2：5'-TGC TCG AGT TAC GGG TTA AGT G-3'(22nt)。产物为430bp的ORF2片段。由上海生工生物工程公司合成。

2 方法与结果

2.1 目的基因的扩增与克隆

提取感染PCV2的PK15细胞总DNA，使用引物ORF2-F1、ORF2-R1进行PCR扩增，得到ORF2片段（593bp），对其胶回收纯化。将纯化好的DNA与T载体的连接成pUCm-PCV2-ORF2质粒，转入DH 5α菌。提取pUCm-PCV2-ORF2质粒，送上海生工生物工程公司测序。将测得的PCV2(PCVJX1) ORF2序列与Genbank已发表的其它PCV2序列进行比对。使用Basi c Local Al i gnm ent Search Tool（BLAST）进行搜索，结果显示该段序列与国内大多数PCV2毒株ORF2的同源性高达99％。

提取pUCm-PCV2-ORF2质粒，用引物ORF2-F2、ORF2-R2对ORF2片段进行高保真PCR扩增。如图1所示，目的条带与预期（430bp）相符。

图1 使用Pf u酶从pU C m-PC V2-O R F2质粒中扩增O R F2片段（M：100bp Ladder；1：扩增产物；2：阴性对照）

对胶回收纯化好的ORF2片段(430bp）、pGEX-4T-1质粒分别双酶切后，连接得到重组质粒pGEX-PCV2-ORF2。转入感受态BL21(DE3)菌。

2.2 目的基因的原核表达

对携带pGEX-PCV2-ORF2质粒BL21(DE3)菌进行诱导表达，产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（见图2）。诱导后的菌在蛋白质M arker 45KDa左右处有明显的条带（箭头所指处），而未诱导的表达菌在该处无明显条带。说明该条带为诱导产物。大小与预期的42KDa相符。产物的量随诱导时间增加不断提高，4h时到达峰值。诱导5h时和诱导4h并没有明显区别，所以确定最佳诱导时间为4h。将诱导4h的菌裂解，分别将上清、沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（见图2）。可见沉淀为比较纯的42KDa条带，而上清中几乎没有目的条带。说明表达产物主要以包涵体的形式存在。

图2 pG EX-PC V2-O R F2表达全菌、上清、沉淀SD S-PAG E（1-4：均为带pG EX-PC V2-O R F2质粒的BL21(D E3)菌;1：未诱导；2：诱导4h全菌；3：诱导4h菌裂解上清；4：诱导4h包涵体）

2.3 表达产物的纯化

将诱导表达的菌用溶菌酶、超声波裂解。加入0.1m ol/L二硫苏糖醇溶液混匀后离心弃去上清。20％脱氧胆酸钠溶液重新悬浮沉淀，再次离心弃去上清，得到高纯度的包涵体沉淀。十二烷基肌氨酸钠溶液充分溶解沉淀，然后用0.3％十二烷基肌氨酸钠缓冲溶液稀释至蛋白浓度为1m g/m L。用复性缓冲液进一步稀释使蛋白浓度至40μg/m L。加入100 m m ol/L还原型谷胱甘肽溶液，使终浓度至2 m m ol/L，混匀后4℃静置1小时。加入20％ PEG4000溶液，使终浓度至0.2％。加入50 m m ol/L氧化型谷胱甘肽溶液，使氧化型谷胱甘肽浓度为1 m m ol/L，4℃静置3小时。装入透析袋中，用十倍体积pH 9.6的碳酸盐缓冲液放置4℃冰箱缓慢透析。10小时后更换碳酸盐缓冲液，重复两次。透析复性后的蛋白液中加入叠氮钠溶液至终浓度0.05％。4℃保存。用分光光度计测定260nm、280nm吸光值，计算蛋白终浓度。

2.4 活性验证

在酶标二抗稀释倍数为1：5000的情况下，将纯化好的蛋白液分别以30μg/m L、15μg/m L、7.5μg/m L、5μg/m L、2.5μg/m L、1.25μg/m L的浓度包被酶标板，每个浓度重复16孔。以1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280 PBS稀释的PCV2阳性、阴性血清进行ELISA方阵试验，在抗原包被浓度为7.5μg/m L和血清稀释倍数为1：80时，阳性血清孔的吸光度值为1.376，阴性血清孔的吸光度值为0.168。P/N值达到了8.19，表明该蛋白有良好的PCV2反应原性。

3 讨论

市面上已有杆状病毒表达制成的PCV2亚单位商品疫苗[2]。由于杆状病毒表达系统成本高，导致该疫苗价格昂贵，目前一般用于种猪接种。大肠杆菌表达系统成本低，但PCV2衣壳蛋白N端有较多的碱性氨基酸和大肠杆菌稀有密码子，不利于在大肠杆菌中表达[3]。在众多大肠杆菌稀有密码子当中,编码精氨酸的AGG和AGA是使用频率最低的两种。当有两个AGA相距很近时,会严重影响翻译进程。本实验克隆的PCV2（JX1株）ORF2序列中包含AGA ATA AGA稀有密码子三联体，会对表达造成很大的影响。本实验最初试图表达克隆得到的593bp片段，但诱导后未获得表达产物，可能就是这个原因。接着本实验选择稀有密码子三联体至3'末端的430bp进行表达。设计引物ORF2-F2对影响表达的稀有密码子三联体进行了同义置换（AGA ATA AGA-＞cgtat tcgt）。将PCV2 ORF2 3'端430bp序列插入表达载体pGEX-4T-1进行表达。全菌SDS-PAGE结果表明表达成功。

表达产物以包涵体形式存在。经过简单的细菌裂解、去杂步骤，能得到纯度较高的包涵体[4]。包涵体的组成比较单一，绝大部分是外源性表达产物。这给蛋白纯化带来了方便。溶解包涵体、复性这一步骤比较繁琐和耗时，这是最关键的一步，决定了活性蛋白的得率[5]。复性好的蛋白可溶，包被酶标板后同猪PCV2阴阳性血清进行反应，ELISA结果表明复性后蛋白有很好的反应原性。

本实验使用的pGEX-4T-1是一种融合表达载体，将克隆基因表达成与谷胱甘肽S-转移酶（GST）相融合的蛋白质。用该载体表达的融合蛋白可以选用GST融合蛋白纯化试剂盒进行纯化。用该载体表达的融合蛋白质包含有凝血酶（Thrombi n）的识别序列，它是由紧挨多克隆位点前的DNA编码的，因此可以选用Throm bi n切除掉GST。

本实验构建的GST-PCV2-ORF2工程菌每100m L菌液可获得20m g的融合蛋白，产量令人满意。已做方阵试验初步确定了ELISA方法的包被蛋白浓度、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数等参数。可进一步与商品化的知名品牌PCV2抗体检测ELISA试剂盒对比验证吻合度。考虑到现实的成本因素，要想实现生猪养殖上能用得起的PCV2原核表达亚单位疫苗，还需继续探索更低成本的原核表达、蛋白纯化方法。

[1]Nawagitgul P,Morozov I.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].Gen.Virol,2000,81：2281-2287.

[2]BeachNM，MengXJ．Efficacyandfutureprospectsof commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus type 2(PCV2)[J].Virus Res,2012，164(1-2)：33-42．

[3]解庭波．大肠杆菌表达系统的研究进展[J]．长江大学学报，2008，5（3）：77-82．

[4]D.R.马歇克，J.T.门永，R.R.布格斯，等.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M]．北京：科学出版社，2000.

[5]高永贵，关治新.包涵体蛋白的变复性研究[J].科技通报，2003，19（1）：27-33.

S852.43

A

1006-4907（2016）04-0039-03

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.021

2016-07-20

李裕（1979～），男，汉族，湖南益阳人，硕士研究生，兽医师，主要从事兽药、饲料，畜产品质量安检测工作，6603770@qq.cpm