左西孟旦对心力衰竭大鼠离体心脏的保护作用及机制研究

张小龙

左西孟旦对心力衰竭大鼠离体心脏的保护作用及机制研究

张小龙

目的 观察左西孟旦对心力衰竭大鼠离体心脏功能的影响，并探讨其作用机制。方法 采用腹主动脉缩窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff离体心脏灌流实验方法，观察左西孟旦对心力衰竭大鼠离体心脏功能的影响，运用不同阻断剂干预后，观察左西孟旦作用的变化。结果 左西孟旦可增强心力衰竭大鼠离体心脏功能，其心率减慢，LVSP-LVDP升高，+dP/Dtmax升高，-dP/Dtmax降低，L-NAME、Gli预处理后，左西孟旦对心力衰竭心脏功能的作用减弱。结论 左西孟旦可以明显改善心力衰竭大鼠离体心脏功能，其作用可能与NO的合成、KATP通道开放有关。

左西孟旦；心力衰竭；离体心脏；心功能

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)严重威胁着人类的健康，它的发病率呈逐年上升趋势，在中国，成年人心衰的患病率约为0.9%，随着老龄化社会的发展，人群中心衰患者人数不断增加。它是缺血性心脏病、高血压病、心肌病、瓣膜性心脏病等各种病因所致心血管疾病发展的最终结局。目前虽然在临床和基础研究方面对CHF的防治取得了一系列重大进展，但是CHF的患病率与死亡率不降反升，5年生存率仍然低于50%。因此基于CHF的研究，特别是临床药物的研究仍然有重要的意义。左西孟旦(levosimendan，Levo)是一种新型强心药物，它通过增加心肌肌钙蛋白对Ca2+的敏感性发挥增强心功能作用，临床中主要用于心脏功能衰竭的治疗和有高手术风险或左心室功能损伤病人的支持性治疗或心外科手术选择性治疗[1- 2]，但是无论基础还是临床研究，其对心脏作用靶点的研究较少。本实验采用腹主动脉缩窄法制作大鼠心衰模型，使用Langendorff离体心脏灌流实验方法，观察Levo对心力衰竭大鼠离体心脏功能的影响，并探讨其可能的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 左西孟旦注射液(Levosimendan，Levo，规格为5 ml：12.5mg)，齐鲁制药有限公司，批号512007F3，左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indo)、四乙胺(Tetraethtylamine，TEA)、格列苯脲(Glibenclamide，Gli)、氯化钡(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)均购自Sigma公司。其余均为化学试剂国产分析纯。

1.1.2 仪器 Langendorff心脏灌流装置，Powerlab生物信号采集分析系统购自澳大利亚ADInstruments公司，恒流泵购自兰格恒流泵有限公司，超级恒温器购自上海仪典仪表电子有限公司。

1.2 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，购自山西医科大学实验动物中心，体重为180 g～220 g。饲料由山西医科大学实验动物中心提供，每笼饲养大鼠5只，室温保持在20 ℃～25 ℃，相对湿度50%左右，大鼠适应性喂养1周后开始实验。将大鼠分为对照组6只、假手术组6只、心衰组50只。

1.3 制备心力衰竭大鼠动物模型

1.3.1 模型制备 心力衰竭模型制备采用腹主动脉缩窄法[3]：健康雄性 Wistar 大鼠，体重180 g～220 g，用40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后，四肢及头部固定于手术台上，开腹，止血钳钝性分离腹壁肌层，分离肾动脉分支稍上处的腹主动脉，7号针头平行腹主动脉，用线结扎此动脉及针头后，拔出针头，使腹主动脉面积为原面积的40%，假手术组分离动脉后只穿线，不接扎，逐层关闭腹腔，术后肌注3 d青霉素以防感染，每天200 U。

1.3.2 模型评价 每天早、 中、 晚观察大鼠精神状态、 活动情况、 皮毛变化、 饮食情况及呼吸频率。12周后表现出明显的CHF体征：表现精神状态差，眼睑分泌物增多，活动能力下降，活动逐渐减少，进食减少，被毛松软，脱毛，呼吸加快，喜欢聚团等。对大鼠进行心功能测定：随机取大鼠，称重记录体重(BW)g后麻醉动物，麻醉动物后分离右颈总动脉切开后插入直径 1 mm且有1%肝素的心导管，接BL-420S生物机能分析系统，缓慢推进同时观测动脉压，描记记录血压曲线。再继续插入，使其通过主动脉瓣进入左心室，描记记录左心室内压(LVP)、心脏舒张期左室内压变化最大速率(±dp/dtmax)等。比较对照组、假手术组和心衰组心功能变化。实验结束后将心脏置于预先备好的4℃的台氏液中。从台氏液中取出心脏，用双层滤纸吸干水分，用电子天平准确称量全心湿重(HW)g；去除心房及瓣膜组织用电子天平称心室湿重(VW)g。最后所称得的结果计算出心脏重量指数(HW/BW)mg/g和心室重量指数(VW/BW)mg/g。比较对照组、假手术组和心衰组的HW/BW和VW/BW。

1.4 离体心脏的制备 大鼠颈总动脉插管，心功能测定结束后，开胸解剖取出心脏，置入4℃台氏液中，去除其余组织后置于Landendorff灌流装置上，用充以95%氧气和5%二氧化碳的台氏液灌流(台氏液成分：NaCl 140mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，Glu 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，HEPES 5.0 mmol/L)，用NaOH调节pH值至7.36。起搏电极位于右室，刺激强度设定为二倍阈强度，刺激频率为每分钟200次。将一直径约4 mm、充有一定台式液的乳胶水囊经由左心房插入至左心室内，水囊导管的一端与压力换能器连接，将灌流速度调整为10 mL/min，对室内压进行测定。拟测定指标为：心率(HR)，左室收缩压(LVSP)，左室舒张压(LVDP)，左室压最大上升速率(+dP/Dtmax)，左室压最大下降速率(-dP/Dtmax)，主动脉收缩压(LVSP-LVDP)。以主动脉收缩压≥8 kPa；为灌流成功标志，稳定60 min，待所观察各心功能指标维持稳定后，开始干预。

1.5 实验方法

1.5.1 Levo对心力衰竭离体心脏的作用 抽取心力衰竭大鼠10只，随机分为空白组和Levo组各5只。空白组持续灌流台式液至实验结束，Levo组往灌流液中加入Levo，使灌流液中Levo的终浓度为0.3 μmol/L。观察两组大鼠离体心脏的HR、LVSP、LVDP、+dP/Dtmax、-dP/Dtmax等心脏功能指标的变化情况。

1.5.2 不同阻断药对Levo作用的影响 将35只心肌肥厚大鼠随机分为7组，每组5只，Levo组和Levo+阻断药组(n=5)，6种阻断药分别为NO合酶(eNOS)抑制剂L-NAME(1×10-4mol/L)、环氧合酶(COX)抑制剂Indo(1×10-5mol/L)、KV通道阻断剂4-AP(1×10-3mol/L)、KATP通道阻断剂Gli(1×10-5mol/L)、KCa通道阻断剂TEA(1×10-2mol/L)、KiR通道阻断剂BaCl2(1×10-3mol/L)。待离体心脏灌流稳定后，Levo组加入Levo终浓度为0.3 μmol/L的台式液，阻断药组则加入阻断剂孵浴10 min后，再加入Levo终浓度为0.3 μmol/L的台式液，观察Levo对心力衰竭离体心脏的作用。

2 结 果

2.1 大鼠心力衰竭模型制备鉴定 12周末，心衰组动物死亡5只，假手术组死亡1只。大鼠心功能测定结果及心脏、心室重量指数计算结果显示(见表1、表2)，大鼠心衰模型成功制备。

表1 各组大鼠心功能结果比较(±s)

表2 各组大鼠HW/BW和VW/BW结果比较(±s)

2.2 Levo对心衰大鼠离体心脏功能的影响 与空白相比，Levo可增强衰大鼠离体心脏心功能。心率减慢(P<0.01)，LVSP-LVDP升高P<0.05)，+dP/Dtmax(P<0.01)升高，-dP/Dtmax降低(P<0.01)，差异有统计学意义。详见表3。

表3 空白组、Levo组心衰大鼠离体心脏心功能指标比较(±s)

2.3 不同阻断药对Levo改善心功能作用的影响 L-NAME及Gli孵浴后，Levo对离体心脏功能增强作用减弱，与Levo组比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；其余阻断药孵浴后，Levo对离体心脏功能影响与Levo组比较，差异无统计学意义。详见表4。

表4 Levo组与阻断药组心力衰竭大鼠离体心功能指标比较(±s)

3 讨 论

腹主动脉缩窄法所致大鼠心衰模型是慢性心力衰竭研究中常用的动物模型，其发病机制明确，程度基本相同，与临床心衰病人的病理变化过程类似。腹主动脉缩窄可以使左心室流出道受阻，后负荷加重而致心力衰竭。本实验制作腹主动脉缩窄法所致的大鼠心衰模型，12周后，大鼠心力衰竭模型成功建立，各心功能指标明显降低。

Langendorff离体心脏灌流模型是研究心血管疾病的成熟装置。离体实验的优势在于它排除了神经、内分泌、体液因素以及心脏前、后负荷对心功能的影响，可以直观观察药物对心功能的影响。本研究的实验指标HR、LVSP、LVDP、±dP/Dtmax是离体心脏灌流中反映心脏收缩与舒张功能的重要指标，HR是反映心脏收缩舒张功能最简单直观的指标，心率减慢，心输出量减少可使血压降低，心率减慢，从而使冠脉灌流时间增多，最终使心肌得到更多的血液供应，对心脏起保护作用。LVSP和+dP/Dtmax主要反映心脏的收缩功能，LVDP和-DP/Dtmax主要反映心脏的舒张功能[4]。Levo作为新一代Ⅱ型Ca2+增敏剂，不同的浓度下具有Ca2+增敏、抑制磷酸二酯酶、抗炎抗氧化等作用[5- 6]。本研究结果表明，和空白组相比，Levo可以使心力衰竭大鼠心率减慢，-DP/Dtmax降低，LVSP-LVDP、+dP/Dtmax则升高，上述心功能指标表明，Levo可显著增强心力衰竭大鼠离体心脏的心功能。

心脏代谢产生的物质以及心脏细胞的蛋白、通道可以通过调节心脏收缩和舒张来影响心功能。例如一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)、K+通道等。NO可通过NO-sGC-cGMP 途径，使sGC激活促使cGMP 生成，后者则进一步作用于cGMP依赖性蛋白激酶使Ca2+内流减少，增加Ca2+-ATP酶对Ca2+的摄取，或直接使收缩蛋白去磷酸化而影响心功能。PGI2是由COX催化花生四烯酸产生的，可舒张冠脉改善心功能。K+通道在调节心脏收缩与舒张中具有重要作用，激活心脏的 K+通道，舒张冠状动脉，可以明显改善心功能[7]。运用L-NAME、Gli预孵心衰心脏后，和单纯灌流Levo离体心脏相比，心率加快，LVSP-LVDP降低，+dP/Dtmax降低，-dP/Dtmax升高，实验结果提示，NO与KATP通道可能参与了Levo改善心脏收缩舒张功能。

Levo的基础和临床研究虽然有了很大的进展，但是其详细作用机制及作用靶点尚不明确。本研究运用离体心衰模型的方法阐明了Levo可以明显改善心力衰竭大鼠离体心脏功能，其作用可能与NO的合成、KATP通道开放有关。

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(本文编辑王雅洁)

山西省心血管病医院(太原 030024)，E-mail：19941680961@qq.com

引用信息：张小龙.左西孟旦对心力衰竭大鼠离体心脏的保护作用及机制研究 [J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(24)：2896-2899.

R541.4 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.014

1672-1349(2016)24-2896-04

2016-09-09)