金银花不同组分对甲型流感病毒神经氨酸酶抑制作用研究

王姣娇 李海波 鲍欣欣 姚辉

金银花不同组分对甲型流感病毒神经氨酸酶抑制作用研究

王姣娇 李海波 鲍欣欣 姚辉

目的筛选金银花抑制流感病毒神经氨酸酶的有效部位，为阐明金银花有效抗流感成分物质基础提供科学依据。方法金银花经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，分别测定不同组分对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用，确定其有效部位。结果金银花乙酸乙酯部位对神经氨酸酶有较强的抑制作用，对H3N2和H1N1流感病毒神经氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）分别为（243．18±18．47）μg/ml和（198．34±9．67）μg/ml。结论基于活性导向，明确了金银花中对流感病毒神经氨酸酶有抑制作用的组分，为阐明其抗流感物质基础及新药开发具有指导意义。

金银花；流感病毒；神经氨酸酶

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病[1]。神经氨酸酶是一种表面糖蛋白，在流感病毒的复制过程中起着重要作用。流感病毒神经氨酸酶的晶体结构已确定，它是由相同亚基组成的四聚体。酶活性位点位于各亚基表面的一个口袋中，在已经鉴定的所有A、B型流感病毒中，结构高度保守[2]。自从确定了流感病毒神经氨酸酶的晶体结构与天然底物唾液酸的共晶结构以来，流感病毒神经氨酸酶抑制剂的研究取得了突破性进展。

目前已有多种流感病毒神经氨酸酶抑制剂已上市，如扎那米韦（zanamivir）和达菲（tamiflu），其对甲型和乙型流感病毒均有效[3-4]。这些化合物对流感病毒疗效确切，但应用过程中耐药株的出现，以及其带来的毒副作用使得这些药物的使用受到一定的限制，开发新型基于抑制神经氨酸酶活性的抗流感病毒药物具有重要意义[5]。金银花为常见中药，具有清热解毒、抗菌消炎、凉散风热、保肝利胆等多种功效。现以体外抗神经氨酸酶作用为指标，对金银花的有效部位进行筛选研究。

1 材料与方法

1.1 金银花购买及其鉴定

实验所用金银花购自新疆百草堂大药房，由新疆药物研究所赵军研究员鉴定。

1.2 金银花组分制备

取金银花粉末50 g，置5 L圆底烧瓶中，分别以1 000 ml的95%乙醇和70%乙醇各回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩（0.1 Mpa，50℃），真空干燥（0.1 Mpa，45℃，12 h），即得药材乙醇提取物。

1.3 提取

将药材乙醇提取物，以500 ml去离子水混悬溶解后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和饱和正丁醇分别萃取5次，各萃取部位减压浓缩（0.1 Mpa，50℃），真空干燥（0.1 Mpa，45℃，12 h），分别得到是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

1.4 H3N2流感病毒神经氨酸酶的制备

在长满MDCK细胞的培养瓶中加入H1N1和H3N2流感病毒，培养液为（含牛血清白蛋白1.2 mg/ml，TPCK胰酶5 μg/ml，DMEM），35℃，5% CO2培养，待细胞完全病变后收集上清，1 500 rpm离心10 min，去除细胞碎片。上清液中加入NP-40，使终浓度为0.1%，作为原酶液，-70℃保存待用。

1.5 神经氨酸酶抑制筛选模型的建立与验证

神经氨酸酶测定试剂盒购自碧云天生物试剂公司，按照试剂盒说明书操作。酶促反应过程如下: 在96孔板中加入70 μl神经氨酸酶检测缓冲液，10 μl神经氨酸酶酶液，10 μl不同浓度的金银花提取物（反应体系中终浓度为500 μg/ml），振荡混匀后37℃孵育60 min，加入10 μl神经氨酸酶荧光底物，再次振荡混匀1 min，用荧光酶标仪检测各孔荧光强度（F），激发波长和发射波长分别为322 nm和450 nm。以扎钠米韦为阳性对照。如抑制率大于50%则进行复筛，分5个浓度梯度，计算样品对流感病毒NA的半数抑制浓度（IC50），实验重复3次。

抑制率=（F酶对照-F空白对照）-（F标本-F空白对照）/（F酶对照-F空白对照）×100%

2 结果

金银花的不同组份均有抑制H3N2流感病毒神经氨酸酶的作用，结果见表1。

3 讨论

根据统计，全球每年的流感病例为6～12亿，其中重症流感为300～500万例，死亡25～50万人，重症流感的病死率可达8%。国外最新研究表明，65岁以上老年人因流感导致肺部感染的可能性是（1.25～2.28）/千人，对于那些患有慢性疾病的老人，因流感诱发肺炎的可能性更大。流感每年导致超过20 000人死亡，并使超过100 000人入院治疗。

流感病毒属于正粘液病毒科，RNA病毒，球型，直径80～120 nm。依据其核蛋白（nucleoprotein，NP）抗原性的差异分成A、B、C三型，分别在基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面存在差异；其包膜分内、外两层，内膜由基质蛋白M1构成；外层包膜由脂质双层构成，其上面嵌有三种病毒蛋白，即血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和基质蛋白（matrix protein，MP）[2]。在每个流感病毒的表面，大约有100个蘑菇形神经氨酸酶糖蛋白分子，其在流感病毒的复制过程中起着重要作用，是抗流感药物的重要靶点之一。

随着抗流感药物的广泛使用，药物的耐药性问题日趋严重，给流感的防控带来极大挑战。结合中药药源丰富、价格低廉且作用靶点多样等优势，遵从中医辨证施治原则，按照“分子中药学”和“方证组方”理论，以抗流感病毒为主攻方向，兼顾扶正固本治则，合理组方，在研制高效低毒的抗流感病毒和防治流行性感冒药物中，中药及其有效成分将展现更广泛的适应性和优越性，并具有广阔的研究前景[5]。

金银花（Flosloniceraejaponicae）药材为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花蕾或带初开的花。金银花的提取物用于生产金银花注射液、银黄注射液、双黄注射液、双黄连粉、金银花流浸膏等多种制剂。金银花还可与多种药物配伍用来治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染，高血压、各种皮肤病、小儿肺炎、腮腺炎、小儿风疹、阑尾炎等诸多病症。

金银花化学成分复杂，已发现的化学成分主要有挥发油类、黄酮类、有机酸类、三萜类等。文献报道表明，以绿原酸、异绿原酸为主的有机酸类，以木犀草苷为主的黄酮类，还有部分的挥发性成分都是本品清热解毒的有效成分[6-8]。绿原酸类化合物是金银花的主要有效成分，包括绿原酸、异绿原酸和咖啡酸。其中异绿原酸为一混合物，它的异构体有七种，分别为4，5-二咖啡酸酰奎尼酸、3，4-二咖啡酸酰奎尼酸、3，5-二咖啡酸酰奎尼酸、1，3-二咖啡酸酰奎尼酸、3-阿魏酰奎尼酸，4-阿魏酰奎尼酸、5-阿魏酰奎尼酸抗流感病毒作用是金银花清热解毒的现代药理基础之一，对其有效部位的研究将为物质基础的阐明提供依据[9-10]。

天然产物神经氨酸酶抑制剂新型流感病毒的潜在威胁和耐药流感病毒株的不断出现，严重威胁着人类的生命健康[11]。从植物中发现天然抗病毒活性化学物质是开发抗病毒药物的重要途径，这也使得越来越多的研究人员希望从天然产物中找到一种新颖的神经氨酸酶抑制剂来解决流感病毒株耐药性的问题[12]。研究按照极性，将金银花进行分组，并测定各个组分对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用，为新型抗流感病毒药物的开发奠定基础。

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[10] 王金丹． 金银花中绿原酸的研究进展[J]． 农业科技与装备，2016，38（6）：59-61．

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Inhibitory Effect of Different Components of Honeysuckle on Neuraminidase of Influenza A Virus

WANG Jiaojiao LI Haibo BAO Xinxin YAO Hui Department of Clinical Laboratory, Nantong Maternity and Child Health Hospital, Nantong Jiangsu 226018, China

ObjectiveTo screen the effective parts of hamercopsin to inhibit the neuraminidase of influenza virus, and to provide scientific basis for elucidating the material basis of effective anti-influenza component of honeysuckle.MethodsThe honeysuckle was extracted with petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol, and the inhibitory effect of different components on the neuraminidase of influenza virus was determined.ResultsThe ethyl acetate fraction of flos lonicerae has a strong inhibitory effect on neuraminidase, the median inhibitory concentration (IC50) for neuraminidase of H3N2 and H1N1 influenza viruses was (243.18±18.47) g/ml and (198.34±9.67)g/ml, respectively.ConclusionBased on the activity-oriented, it is clear that the components of the hamisinchins have inhibitory effect on the neurospitase of influenza virus, and it is of significance to elucidate its anti-influenza material base and new drug development.

honeysuckle; influenza virus; neuraminidase

R243

A

1674-9316（2017）22-0098-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．22．049

江苏省南通市应用基础研究课题（MS12015020）

江苏省南通市妇幼保健院检验科，江苏 南通 226018

李海波