急性高眼压模型中p75NTR>抑制剂对视网膜神经节细胞作用的研究

汪晓磊 马建民 孟照洋 尹 奕 王艳玲

(1.首都医科大学附属北京友谊医院眼科，北京 100050;2.首都医科大学附属北京同仁医院眼科，北京 100730)

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急性高眼压模型中p75NTR>抑制剂对视网膜神经节细胞作用的研究

汪晓磊1*马建民2孟照洋1尹 奕1王艳玲1

(1.首都医科大学附属北京友谊医院眼科，北京 100050;2.首都医科大学附属北京同仁医院眼科，北京 100730)

目的 验证通过抑制p75NTR(p75 neurotrophin receptor)可降低急性高眼压(acute ocular hypertension, AOH)对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的损伤作用。方法应用大鼠急性高眼压模型，玻璃体腔注射p75NTR抑制剂(TAT-Pep5)，按建模后1、3、5 d取材，分为正常对照组、假手术组、急性高眼压组、急性高眼压+TAT-Pep5组。采用免疫荧光技术、Western blotting等方法检测急性高眼压模型中相关蛋白的表达变化。TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况。结果急性高眼压模型视网膜Müller细胞上proNGF表达增加。注射p75NTR抑制剂TAT-Pep5后急性高眼压视网膜上cleaved-caspase 3蛋白量减少，并且RGCs凋亡数目减少。结论视网膜神经节细胞损伤可引起proNGF表达增加，选择性阻断Müller细胞上的p75NTR或干预其信号传导通路，可以减少急性高眼压模型中RGCs凋亡。

急性高眼压；p75NTR；神经生长因子前体；TAT-Pep 5抑制剂；Müller细胞

青光眼作为一种最常见的不可逆性致盲眼病，其有效防治成为防盲、治盲和公共卫生工作的重点。河北邯郸的流行病学调查[1]结果显示我国30岁以上人群中，由于青光眼导致的盲目占9.7%，预计2020年我国青光眼病人将高达2 800万。

青光眼特征性损害的病理基础是在各种损伤因素作用下导致的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)变性死亡[2]。在青光眼中启动RGCs凋亡的具体机制尚不清楚。研究[3-4]证实proNGF通过与p75NTR(p75 neurotrophin receptor)和Sortilin结合形成三聚体，进而介导了视网膜发育过程中RGCs的凋亡。本课题组前期研究发现急性高眼压大鼠视网膜中，p75NTR和Sortilin蛋白表达量增加。本课题拟验证通过抑制p75NTR可降低急性高眼压对视网膜神经节细胞的损伤作用，从而为青光眼视神经保护的研究提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康Sprague-Dawley雄性大鼠，体质量200～250 g、8～10 周，SPF 级别，由首都医科大学动物部提供，实验动物许可证号：SCXK(京)：2012-0001。采用数字表法随机分为正常对照组(Ctrl，n=10)、假手术组(Sham，n=10)，急性高眼压组(acute ocular hypertension，AOH，n=20)和急性高眼压加玻璃体注药组(AOH+TAT，n=20)，按处理时间分为1、3、5 d，随机选用一眼作为实验眼。免疫荧光染色选处理后5 d做观察。每组动物n=5。小鼠源性单克隆p75NTR(美国Santa Cruz公司)，兔源性多克隆cleaved-caspase 3抗体(美国Cell signaling公司)，兔源性多克隆proNGF抗体(美国Sigma公司)，FITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗兔IgG、TRITC 标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，β-actin小鼠源性单克隆抗体(美国Proteintech公司)，TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)，TAT-Pep5(美国Calbiochem公司)。

1.2 动物模型制作

所有实验操作均遵循美国视觉与眼科学研究会(American Society for Vision and Ophthalmology,ARVO)有关眼科和视觉科学实验动物使用规范，并得到首都医科大学动物管理委员会的许可。实验前首先排除动物眼部或全身性病变。参照文献[5]，大鼠10%(质量分数)水合氯醛腹腔注射麻醉后，复方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，倍诺喜眼液点眼表面麻醉。将27号针头沿大鼠眼球颞侧角巩膜缘刺入前房，针头另一端连接500 mL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液，使眼内压达110 mmHg( 1 mmHg=0.133 kPa)，术眼出现球结膜水肿、角膜水肿、虹膜及视网膜颜色苍白、血管断流等指征为缺血开始标志，持续1 h。术眼用红霉素眼膏防止感染。手术完成后，各组分别在术后1、3、5 d过量麻醉处死动物，冰浴下取术眼。急性高眼压处理后 3 h给药。用10 μL微量注射器(hamilton)经穿刺口进入玻璃体腔，缓慢推注5μL TAT-Pep5。Sham组仅做前房穿刺，不升高眼压。

1.3 免疫荧光染色

分别应由兔源性多克隆proNGF抗体(1∶200)、鼠源性单克隆p75NTR(1∶400)4℃过夜，室温孵育1 h；加1∶400的二抗溶液，室温下避光1h；滴加Propidium iodide溶液，室温避光；加盖玻片，指甲油封固，4℃避光保存。用Olympus FV1000共聚焦显微镜采集照片。

1.4 Western blotting法检测

摘取大鼠眼球，完整分离视网膜组织。参照Sigma公司提供的蛋白抽提试剂及方法，参照BCA试剂盒说明。取总蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白电泳；转膜，漂洗，封闭，漂洗。应用兔源性多克隆proNGF抗体(1∶1 000)、兔源性多克隆cleaved-caspase 3抗体(1∶1 000)和鼠源性β-action(1∶20 000)4℃过夜，室温孵育30 min。应用HRP标记的二抗(1∶4 000)孵育，室温1h。TTBS漂洗3次。电化学发光法显色发光、胶片曝光。应用图像分析软件Quantity One，对胶片中蛋白条带进行灰度值分析，并以β-actin 蛋白为内参，计算各组蛋白与β-actin 的灰度比值，进行半定量分析。

1.5 TUNEL检测

视网膜切片经干燥、水化、固定，乙醇∶乙酸(2∶1)处理5 min；0.2%(体积分数)Triton-100破膜；Equibibration buffer 作用5～10 min；TdT孵育37度水浴75 min，混合物配比：平衡液45 μL、核苷混合物5 μL、rTdT酶1 μL；2×SSC 15 min终止反应(20μL +180μL PBS)；封片，观察。每个视网膜切片选取10个视野进行计数分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 急性高眼压对大鼠视网膜中proNGF和p75NTR表达的影响

通过免疫荧光共标结果显示，proNGF和p75NTR在Müller细胞中共表达，主要集中在Müller细胞的终足和突触(图1A)。Western blotting 法检测结果显示proNGF蛋白条带对应的27 000相对分子质量。与正常对照组(Ctrl,100%)比较，假手术组(Sham)、术后1 d、3 d、5 d大鼠视网膜组织内proNGF蛋白的表达量分别为99.2±0.01、240.15±31.18、260.29±12.61、202.77±0.36。急性高眼压模型视网膜内proNGF蛋白的表达量升高(P<0.05，n=5)(图1B、C)。

图1 急性高眼压模型视网膜中proNGF和p75NTR表达情况

A: colocalization of proNGF (green) and p75NTR(red) in retinas(n=5) by Confocal microscopy images; B:proNGF protein expression in AOH retinas(n=5) by Western blotting; C:quantitative analysis of proNGF protein expression levels(n=5);*P<0.05vsCtrl；P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension.Ctrl：control group.

2.2 p75NTR抑制剂TAT-Pep5对急性高眼压视网膜中RGCs凋亡的影响

采用TUNEL染色标记凋亡细胞，探讨TAT-Pep5对急性高眼压视网膜中RGCs影响。在AOH组视网膜中的RGCs凋亡细胞数目显著增加，而AOH+TAT-Pep5组凋亡细胞数减少(图2)。

2.3 p75NTR抑制剂TAT-Pep5降低急性高眼压视网膜中cleaved-caspase 3蛋白的表达

Western blotting检测结果显示cleaved-caspase 3对应的17 000相对分子质量。与正常对照组(Ctrl,100%)比较，假手术组(Sham)、AOH组、AOH+TAT-Pep5组大鼠视网膜组织内cleaved-caspase 3蛋白的表达量分别为99.2±0.01、327.22±12.61、150±30.52。AOH+TAT-Pep5组、AOH组中的cleaved-caspase 3蛋白的表达量高于正常对照组(P<0.05，n=5)。Cleaved-caspase 3蛋白表达量在AOH组中明显高于AOH+ TAT-Pep5组，差异有统计学意义(P<0.05，n=5)(图3)。

图2 p75NTR抑制剂对急性高眼压视网膜上RGCs凋亡的影响

A:TUNEL staining were performed 5 days after AOH;B:The results showed that AOH caused significant increase of TUNEL-positive cells, but TAT-Pep5 could abolish this effect (n=5).*P<0.05vsAOH;P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension；RGCs：retinal ganglion cells.

图3 抑制p75NTR对AOH大鼠视网膜内cleaved-caspase 3蛋白表达水平影响

A:Western blotting results showed the effect of TAT-Pep5 on cleaved-caspase 3protein expression in retinas at 5 d after AOH; B: Quantitative analysis of cleaved-caspase 3 protein expression levels.*P<0.05vsCtrl,#P<0.05vsAOH group.P75NTR：p75 neurotrophin receptor；AOH：acute ocular hypertension;Ctrl：control group.

3 讨论

研究[6-7]表明神经营养因子影响成熟神经元的变性。神经营养因子家族包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养因子3(neurotrophin 3，NT-3)、神经营养因子4/5(neurotrophin 4/5，NT-4/5)。

神经营养因子有两类细胞表面受体[8]。一类原肌球蛋白激酶受体家族(tropomyosin related kinase，Trk)，主要与成熟神经营养因子结合，TrKA是NGF的受体，TrKB是BDNF和NT-4/5的受体，TrKC是NT-3的受体。另一类是p75NTR，是一种重要的神经元信号蛋白，可与全部的神经营养因子结合[9]。Kaplan等[10]研究结果显示： proNGF可以同时激活p75NTR和 Sortilin这两种细胞表面蛋白，继而介导神经元细胞的凋亡。研究[11-16]发现，p75NTR和sortilin参与proNGF引起的成年啮齿类视网膜神经节细胞凋亡。

本研究结果表明在视网膜中proNGF主要表达在Müller细胞。在急性高眼压后1、3、5d的视网膜中，proNGF皆有表达，主要表达在Müller细胞和内层的视网膜。p75NTR主要表达于Müller细胞体和轴突中。

本研究发现在急性高眼压动物模型视网膜中proNGF表达增高，成熟视网膜中p75NTR主要表达于Müller细胞终足，而不是RGCs。这就提示在急性高眼压模型中proNGF也可能通过与p75NTR和Sortilin结合形成三聚体，进而介导了视网膜高眼压损伤中RGCs的凋亡。为了验证p75NTR信号通路对RGCs凋亡的影响，本研究使用了p75NTR的抑制剂TAT-Pep5。本实验结果显示选择性阻断p75NTR信号通路后急性高眼压视网膜中RGCs凋亡数量减少；视网膜上RGCs凋亡数量在AOH+TAT-Pep5组与AOH组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。说明p75NTR抑制剂在一定程度上影响RGCs凋亡。本研究结果显示在急性高眼压视网膜中cleaved-caspase 3蛋白表达增加；而在用p75NTR抑制剂处理后，急性高眼压视网膜中cleaved-caspase 3蛋白表达较AOH组明显降低。这些发现说明急性高眼压可造成内源性的proNGF表达增加，而proNGF可能通过与p75NTR结合从而参与调控RGCs的凋亡；而在阻断p75NTR后可以减少细胞凋亡，从而促进RGCs细胞的存活。

本研究结果表明，通过选择性阻断Müller细胞上的p75NTR或干预其信号传导通路，可以减少急性高眼压模型中RGCs凋亡。本研究可能为保护RGCs的研究提供理论和实验依据。

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编辑 慕 萌

Roles of p75NTRinhibitor on retinal ganglion cells in a rat model of acute ocular hypertension

Wang Xiaolei1*, Ma Jianmin2, Meng Zhaoyang1, Yin Yi1, Wang Yanling1

(1.DepartmentofOphthalmology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China; 2.DepartmentofOphthalmology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China)

Objective To explore the role of p75NTRinhibitor on suppressing retinal ganglion cells (RGCs) apoptosis in a rat model of acute ocular hypertension. Methods The acute ocular hypertension (AOH) rat model was established, and animals were divided into control (Ctrl), sham operation, AOH, AOH+ TAT-Pep5 treated groups (1,3 and 5d subgroups). Immunofluorescent staining was performed to detect the expression of proNGF and p75NTR. Western blotting was used to detect the protein expression levels of proNGF and cleaved-caspase 3. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. Results The expression of proNGF was increased in acute ocular hypertension model. When the p75NTRwas blocked by its inhibitor (TAT-Pep5), the number of death RGCs (TUNEL positive cell number) were less than that of AOH group. The results of Western blotting showed that the protein expression levels of cleaved-caspase 3 could be up-regulated in retina from AOH group or down-regulated in retina from AOH+TAT-Pep5 group when compared with that of Ctrl and AOH groups. Conclusion RGCs injury can increase proNGF expression. p75NTRblockade can potentiate the survival of RGCs.

acute ocular hypertension；p75NTR；proNGF；TAT-Pep 5 inhibitor；Müller cell

首都医科大学基础-临床科研合作基金(14JL32)，首都医科大学重点实验室开放研究课题(2015YKSJ02)。This study was supported by Clinical-Basic Cooperation Program from Capital Medical University(14JL32)，Beijing Ophthalmology and Visual Sciences Key Laboratory (2015YKSJ02).

时间：2017-01-17 23∶49

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2349.022.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.005]

R 775

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：wang1xiaolei@126.com