一氧化氮及其衍生物在缺血性脑血管病中的作用

黄语悠 房亚兰 刘克建 赵咏梅

(首都医科大学宣武医院 北京市老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室 脑血管病转化医学北京市重点实验室，北京 100053)

· 脑血管病、认知障碍的基础及临床研究 ·

一氧化氮及其衍生物在缺血性脑血管病中的作用

黄语悠 房亚兰 刘克建 赵咏梅*

(首都医科大学宣武医院 北京市老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室 脑血管病转化医学北京市重点实验室，北京 100053)

缺血性卒中是导致死亡的主要原因，也是世界上最常见的致残原因之一。脑缺血损伤能促进一氧化氮(nitric oxide， NO)的形成。过量的NO在缺血性脑损伤的发展过程中起着至关重要的作用。NO可能通过直接攻击蛋白质和脂质等生物大分子、破坏线粒体功能，或间接影响细胞信号转导通路和基因调控，从而加重缺血性脑损伤。过量的NO可能具有神经毒性，导致兴奋性神经毒性级联反应、炎性反应和细胞凋亡。然而，NO也可能在脑缺血过程中发挥神经保护作用。本文拟对NO及其衍生物在脑缺血损伤中的作用进行综述。

一氧化氮；缺血性脑血管病；过氧亚硝基阴离子；三氧化二氮

一氧化氮(nitric oxide， NO)是一种无负荷、自由基性质的小分子，作为生物信使分子，在动物体内发挥着重要作用。其化学结构非常简单，半衰期极短，性质极为不稳定。

因NO相对分子质量小，且带有不成对电子，亲脂性强，因而能够以自由扩散的方式通过细胞膜，进而能够特异地参与机体的生理及病理过程，是极为重要的信息分子。NO既能导致炎性反应、兴奋性毒性和凋亡，发挥神经毒性作用，又能抑制血小板聚集、白细胞黏附，舒张血管，维持血流量[1]。

1 NO在体内的来源及作用

1.1 体内NO的来源

1.1.1 经NOS途径产生的NO

根据NOS的来源和表达方式不同，NOS可分为3种类型：内皮细胞型NOS(endothelial NOS， eNOS) 、神经元型NOS(neuronal NOS， nNOS)和诱导型NOS(inducible NOS， iNOS)。

神经组织内nNOS和血管内皮细胞中的eNOS在生理条件下即可广泛表达，产生的NO作为生物信使分子和血管活性因子，介导信息传递、记忆形成、调节脑血流等。而在病理条件下，炎性细胞、巨噬细胞和胶质细胞等表达的iNOS大量增加，产生过量的NO，进而在中枢神经系统发挥神经毒性作用，所以iNOS被认为是一种“病理型”的酶[1]。

1.2 NO在体内的作用

NO在体内的作用可分为直接作用和间接作用[4]。当NO的局部浓度低于μmol/L水平时，可迅速与鸟苷酸环化酶等反应，发挥生理作用，即NO的直接作用。而NO的“毒性作用”是指病理条件下，局部NO浓度剧升，与周围的氧自由基等反应生成活性氮氧化合物，再由活性氮氧化合物发挥细胞毒性作用，造成组织损伤[5-6]。

1.3 介导NO间接作用的衍生物的生成

1.4 ONOO-与N2O3的氧化作用

1.4.1 ONOO-介导的氧化应激

ONOO-是一种强氧化剂，可使许多重要的蛋白质或酶失活，破坏线粒体结构，影响细胞代谢，并使DNA链断裂，诱发脂质过氧化，最终导致组织损伤[9]。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)是ONOO-氧化的稳定产物，目前已在多种疾病中被检测到，3-NT的多少与组织损伤成正相关，故3-NT也可作为检测组织内NO及其衍生物含量的有效指标。

1.4.2 N2O3及其衍生物介导的亚硝基化应激

N2O3性质不稳定，能够与氨基、巯基等发生反应，产生亚硝基胺和亚硝基硫醇等[10]。其中，亚硝基胺可破坏某些蛋白质对于DNA的修复功能，导致DNA突变、受损，最终引起细胞死亡。而亚硝基硫醇的作用广泛，它能生成NO，使血管舒张；也能通过对氧化态的NO基团进行转移，进而调控基因转录。并且亚硝基硫醇能够抑制某些酶和蛋白的活性，干扰细胞代谢，诱导细胞死亡。

N2O3与不同的底物反应，导致不同的亚硝基化应激，可以损伤细胞，也可以保护细胞。如脂多糖/干扰素-γ诱导小鼠原代巨噬细胞产生的氧化应激并不强，但会造成强烈的亚硝基化应激，使蛋白质亚硝基化水平显著升高，造成细胞死亡[11-12]。此外，研究[13]显示，NMDA引起神经细胞损伤，但氧化态NO基团可使NMDA受体亚硝基化，从而降低该受体活性，保护神经元。

2 NO及其衍生物的检测

NO及其衍生物的测定对理解疾病的病理、生理过程有着重要的意义。但是由于细胞内NO释放量低，且释放后的NO能够迅速扩散并与体内其他分子发生反应，因此体内NO的测定比较困难。

作为目前比较常见的NO荧光探针，DAF需要与氧化的NO产物进行反应。因此，DAF在缺氧条件下对NO的检测效果不理想[18]。鲁米诺法[19]测定NO则是通过将体内NO氧化生成ONOO-后与鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)反应发出强光，此法的缺陷在于易受到体内还原性物质的影响。

配位化合物MNIP-Cu在富氧和缺氧条件下均可快速且特异性地与NO反应，产生具有蓝色荧光的产物[20]。Horn等[21]通过自行合成的MNIP-Cu探针检测冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)病人血浆中NO浓度；将自行合成的MNIP-Cu溶液注入活体大鼠脑室，可于大脑切片中观察到蓝色荧光信号，且信号强度与脑中NO浓度成正比[22]。

3-NT是ONOO-使酪氨酸等氨基酸硝基化的产物，因此可以通过检测3-NT来间接反映体内ONOO-的水平。本课题组前期研究[24]通过检测脑组织中3-NT，发现常压高浓度氧可降低脑缺血后脑组织中的NO。用免疫组织化学法检测SD大鼠胸主动脉的3-NT表达，发现老年鼠血管中3-NT的表达较年轻大鼠明显升高[25]。减少过氧化氢诱导的NO和3-NT产生，对神经细胞具有保护作用，可以减轻脑缺血再灌注损伤[26-27]。

3 NO与缺血性脑损伤

3.1 脑缺血性损伤过程中NO的来源

在缺血超早期，eNOS产生的NO的毒性作用可被侧支循环的增加抵消，故对缺血再灌注产生的影响很小。虽然nNOS和iNOS生成的NO均可导致神经毒性损伤，但由于nNOS半衰期短，产生的NO较少，对神经组织的损伤作用较小，因此在缺血再灌注后期影响甚微。用nNOS抑制剂—7-硝基吲唑对大鼠进行预处理可将NOx产生峰延迟至30 min并减弱NOx的总量，说明缺血超早期主要通过上调nNOS表达产生NO[24]。病理条件下经48 h方可诱导iNOS mRNA的表达，产生大量的NO，且iNOS mRNA的半衰期很长，一经诱导合成，即可持续翻译合成iNOS，进而促使大量的NO产生，引起迟发性脑损伤，因此在缺血再灌注中的作用至关重要[1，29]。使用iNOS基因敲除鼠制备大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型或在小鼠MCAO模型中使用iNOS抑制剂，均可显著减轻缺血半暗带区的神经损伤，减少梗死体积[30]。

3.2 缺血-再灌注过程中NO的变化规律

有研究[5，30]显示，脑缺血后，nNOS和eNOS介导NO迅速升高，于5～15 min达到高峰，之后60 min内下降至缺血前水平。若缺血继续，则NO继续下降。到再灌注时NO又逐渐升高，至再灌注24 h达到高峰，再灌注7 d时NO仍高于缺血前水平。如果缺血时间超过6 h，炎性反应细胞表达的iNOS可使NO再次升高[5，30]。研究[1，31]表明，不同的缺血方式引起iNOS表达的时间也不同。iNOS mRNA在永久性MCAO后6 h开始表达，2 d达到高峰；而短暂性MCAO后，iNOS mRNA在再灌注后12 h即达到高峰，4 d左右恢复至缺血前水平。

3.3 缺血-再灌注时NO的作用及机制

研究[1，32]显示，使用eNOS基因缺陷小鼠制备MCAO模型，其梗死体积比野生型小鼠增大，说明eNOS合成的NO具有保护脑缺血损伤的作用。局灶性脑缺血2 h再灌注早期(15 min)，半暗带区的神经细胞及血管eNOS表达上调，但未见iNOS表达，说明此时脑内的NO主要来源于eNOS，其可能通过抑制血小板聚集、白细胞黏附，舒张血管等功能增加侧支循环、防止微血管堵塞，维持脑血流，减轻脑损伤。此外，NO也能抑制Ca2+通过NMDA受体内流，进而抑制谷氨酸的神经毒性[33]。

4 总结

NO及其衍生物在脑缺血损伤中发挥了重要作用，明确其在缺血性脑血管病中的作用机制，对探明脑缺血再灌注过程的病理生理变化具有重要意义，并可能为脑损伤与脑保护剂的研究开辟新视野。已有研究[30-35]表明，在脑缺血再灌注过程中，给予选择性iNOS抑制剂或促进eNOS活性，可以减少缺血再灌注损伤，保护半暗带神经元，这为缺血性脑血管病的治疗提供了新思路。但关于NO及其衍生物，目前还有许多问题没有阐明。NO及其衍生物在脑缺血损伤中的作用值得深入探索与研究。

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编辑 慕 萌

Role of nitric oxide and its derivatives in ischemic cerebrovascular disease

Huang Yuyou， Fang Yalan， Liu Kejian， Zhao Yongmei*

(XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingGeriatricMedicalResearchCenter，KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，BeijingKeyLaboratoryofTranslationalMedicineforCerebrovascularDiseases，Beijing100053，China)

Ischemic stroke is the major cause of death and remains as one of the most common causes of disability worldwide. It is well known that cerebral ischemic injury enhances the formation of nitric oxide (NO). It is believed that excessive NO production plays an important role in the development of ischemic brain injury. NO probably contribute to ischemic injury by attacking macromolecules directly, including proteins and lipids, and disrupting mitochondrial function, or indirectly affecting cellular signaling pathways and gene regulation. Excessive production of NO may be neurotoxic, which leads to cascade reactions of excitotoxicity, inflammation and apoptosis. However, NO may also play a neuroprotective role in brain ischemia processes. In this paper, the role of NO and its derivatives in cerebral ischemic injury are reviewed.

nitric oxide (NO); ischemic stroke; peroxynitrite；N2O3

国家自然科学基金(8161001163)，北京市自然科学基金(7122036)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (8161001163)， Natural Science Foundation of Beijing (7122036).

时间：2017-01-17 23∶54

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2354.054.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.014]

R 743.31

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：yongmeizhao@hotmail.com