白芍总苷对Nc/Nga小鼠特应性皮炎的保护作用

刘 斌 李 静 胡惠清 朱 里

·论著·

白芍总苷对Nc/Nga小鼠特应性皮炎的保护作用

刘 斌1李 静1胡惠清1朱 里2

目的： 确定白芍总苷(Total Glucosides of Paeony,TGP)对小鼠特应性皮炎的保护作用。方法： 利用2,4-二硝基氯苯(DNCB)建立Nc/Nga小鼠实验性特应性皮炎模型。30只小鼠分为3组：正常对照组，模型组，实验组(TGP治疗)，每组10只。实验组连续灌胃用药2周，分别于第8 d、15 d测量各组小鼠背部皮损厚度和皮肤质量，并利用ELISA法分别检测第8 d、15 d血清中细胞因子IFN-γ，IL-4,IL-5和IgE的表达。结果： 白芍总苷治疗第8 d、15 d，皮损厚度变薄及皮损皮肤质量明显减小(P<0.05)，血清细胞因子IL-4、IL-5和IgE水平明显低于模型组，IFN-γ水平明显高于模型组(P<0.05)。结论： 白芍总苷可能通过促进IFN-γ分泌，下调炎症因子IL-4、IL-5水平以及抑制IgE表达从而对小鼠特应性皮炎产生保护作用。

白芍总苷； 特应性皮炎； 细胞因子； 小鼠

特应性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)的病因尚未明确，可能与吸入性过敏原刺激、自身抗原、遗传易感性、感染及皮肤功能下降等有关[1,2]。中药治疗AD具有独特疗效[3,4]，白芍总苷(Total Glucosides of Paeon, TGP) 是传统中药白芍根的主要有效成分，具有调节免疫平衡，抗炎及抗免疫学疾病的功效[5,6]。研究发现，TGP在小鼠糖尿病肾损伤、类风湿性关节炎以及强制性脊柱炎等疾病中具有有效抑制炎性反应的作用[7-9]。为探索TGP对于特应性皮炎中炎症反应的影响，本实验采用Nc/Nga小鼠作为特应性皮炎的模型，以观察白芍总苷对Nc/Nga小鼠特应性皮炎皮肤情况以及血浆细胞因子的影响，旨在为探索白芍总苷对特应性皮炎的影响以及相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 6周龄健康、清洁SPF级Nc/Nga小鼠30只(武汉大学医学院动物实验中心)，雄性，体质量25～30 g。适应性饲养1周，各组小鼠分笼饲养。白芍总苷(Sigma公司，美国)；干扰素γ (IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫检测试剂盒(Invitrogen公司，美国)；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 特应性皮炎动物模型建立和给药各组小鼠在清洁级动物实验室适应性饲养1周后进入实验。剔除小鼠背部面积约3 cm×3 cm皮肤，并于暴露皮肤处涂100 μL 1% 2，4-DNCB进行诱导。1周后于背部剃毛处外涂50 μL 0.1% DNFB进行激发，每周2次，诱发皮炎。于用药后第8天再次给予50 μL 0.5% 2,4-DNCB激发1次[10]。小鼠皮肤出现红斑、鳞屑、结痂等视为造模成功，造模成功24 h后实验组开始灌胃给予白芍总苷，每天给药1次，按体重每次1 mL/100 g灌胃，共给药14 d，模型组和空白对照组给予等体积生理盐水处理(图1)。

1.2.2 皮肤质量和皮肤厚度的测定在造模后第8 d和第15 d，用10 mm打孔器选取小鼠背部皮肤3个非重复部位打孔，用电子称测量质量，各组皮肤质量取平均值；皮肤厚度：第8天和第15天，打孔方法相同，小鼠背部皮肤厚度(mm)利用皮肤测微仪测量，各组皮肤厚度取平均值。

1.2.3 IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE含量检测分别于第8 d和15 d取小鼠眼眶静脉血，抗凝血在4℃下2000×g离心30 min后冻存于-20℃冰箱待测，Elisa法检测血浆中IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE水平。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤情况造模后，模型组小鼠皮肤出现红斑及血性渗出，并出现散在出血点和黄色斑块，经白芍总苷治疗8天后，实验组小鼠皮肤红斑及渗出基本消失，并出现黄色厚薄不一的痂皮，治疗15天后痂皮基本脱落并长出新发(图1)。

图1 造模后第8 d 、15 d各组大鼠皮肤外观

2.2 白芍总苷对小鼠皮肤质量的影响造模成功后第8 d和15 d：模型组小鼠背部皮损处皮肤质量分别为(58.4±1.9)mg和(49.5±2.1)mg，正常对照组为(29.7±1.9)mg和(30.8±2.1)mg。两组比较，模型组皮损皮肤质量明显增多(P<0.05)，而用药后实验组小鼠背部皮损皮肤质量分别为(44.9±1.9)mg和(36.5±1.8)mg，较模型组明显降低(P<0.05)。

2.3 白芍总苷对小鼠皮肤厚度的影响造模成功后第8 d和15 d：模型组小鼠背部皮损皮肤厚度为(805.3±38.4)μm和(609.5±33.7)μm，正常对照组为(381.7±29.3)μm和(378.4±28.1)μm。两组比较，模型组小鼠皮肤厚度明显增加(P<0.05)。用药后实验组小鼠背部皮损皮肤厚度为(549.9±30.5)μm和(481.6±30.8)μm，较模型组明显降低(P<0.05)。

2.4 白芍总苷对小鼠血浆IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影响造模后第8 d、15 d：模型组血浆细胞因子IFN-γ含量下调，用药后实验组IFN-γ含量上调，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；细胞因子IL-4 、IL-5、IgE含量增高，用药后含量均降低，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 造模后第8 d 和15 d白芍总苷对小鼠血浆IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影响

注：*P<0.05,与正常组比较；#P<0.05,与模型组比较

3 讨论

免疫功能异常是引发AD的重要机制之一，研究证实，在AD患者体内血浆免疫球蛋白E(IgE)和Th2型细胞因子水平均明显提高[11]。众所周知，Th1和Th2细胞因子之间相互拮抗，而IFN-γ是Th1群细胞主要分泌的细胞因子之一， IL-4和IL-5则是Th2群细胞主要分泌的细胞因子之一， Th1/Th2之间保持平衡对于机体免疫功能具有重要意义，Th1/Th2的平衡失调可导致一系列疾病，如过敏性疾病，免疫失调等[12,13]。而实验所研究的特应性皮炎主要是Th2诱导的过敏性疾病，Th2分泌的IL-4及IL-5可促使淋巴B细胞产生IgE，而Th1分泌的IFN-γ则可明显抑制IgE的合成和发展，特应性皮炎小鼠皮损的严重程度与IgE水平相关[14]。Sugiura等[15]通过研究发现，特应性皮炎Nc/Nga小鼠皮损中分泌IL-4和IL-5的细胞明显增多，并且随周龄增长而增加。研究发现IL-12在免疫反应中诱导IFN-γ表达，抑制IL-4和IL-5，从而诱导机体免疫反应朝着Th1型方向发展[16]。IFN-γ可抑制Th2类细胞因子IL-4和IL-5的分泌，抑制其向Th2分化，促使免疫反应向Th1分化，并可阻断IgE的合成，下调嗜酸粒细胞的表达和浸润，以减轻特应性皮炎的发生和发展[17,18]。因此，降低AD患者IgE表达水平、抑制Th2型细胞因子的分泌，抑制Th2型免疫反应，使之朝着Th1方向发展，有望成为AD治疗的关键靶点。

在本实验中，模型组小鼠首次DNCB刺激后，小鼠背部出现鳞屑、红斑等现象，第2次刺激后，小鼠背部红斑、鳞屑加重，第3次刺激后，小鼠背部严重红斑及厚痂形成。实验组在用药第8天及第15天均明显减轻AD皮肤质量和皮肤厚度。实验组在用药第8天及第15天，血清IL-4、IL-5以及IgE水平显着低于模型组，IFN-γ含量明显高于模型组，提示白芍总苷对AD作用机制至少是通过抑制小鼠皮损和血清中Th2类细胞因子水平，提高Th1类细胞因子表达，调节Th1和Th2平衡从而起抑制特应性皮炎的作用。

本实验研究证实，白芍总苷对小鼠特应性皮炎具有抑制作用，可通过上调Th1分泌的IFN-γ，抑制Th2分泌的IL-4、IL-5，进而抑制IgE合成和表达，调节Th1/Th2平衡从而对特应性皮炎产生一定的治疗作用，这为临床特异性皮炎治疗的研究提供了新的方向。

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(收稿：2016-05-03 修回：2016-08-27)

Effect of the total glucosides of paeony on experimental atopic dermatitis in mice

LIUBin1,LIJing1,HUHuiqing1,ZHULi2.

1.DepartmentofDermatology,TheNinthHospitalofWuhanCity,Wuhan430080,China; 2.DepartmentofDermatology,HuaZhongUniversityofScienceandTechnology,UnionHospitaloftongjiMedicalCollege，Wuhan430030,China

ZHULi,E-mail:wqlb3344@163.com

Objective: To determine the effect of total glucosides of paeony (TGP) on atopic dermatitis in mice. Methods: An atopic dermatitis model was established on the back of NC/Nga mice with DNCB. Thirty mice were divided into 3 groups: control group, model group and TGP group (10 mice in each group). The mice of TGP group were treated by TGP for 14 days. The levels of serum cytokines including IL-4 and IL-5, IFN-γ and IgE were detected with ELISA kit at day 8th and 15th. Results: TGP could significantly decrease the skin thickness and weightness at 8 days and 15 days (P<0.05). The levels of IL-4,IL-5 and IgE were significantly decreased , while the level of IFN-γ was increased in TGP group, compared with other groups. Conclusion: TGP has protective effects on atopic dermatitis in mice, which may be through inhibiting production of IgE, IL-4 and IL-5, and promoting the secretion of IFN-γ.

total glucosides of paeony; atopic dermatitis; cytokines; mice

1武汉市第九医院皮肤科,430080 2华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科,武汉，430030

朱里，E-mail: wqlb3344@163.com