蒺藜皂苷对人黑素瘤A375细胞酪氨酸酶和小眼相关转录因子表达的影响

张丽宏，安丽凤，黄敬文，鲁光宝，刘海洲，王佳娜，王英莲，王兴焱

(黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

蒺藜皂苷对人黑素瘤A375细胞酪氨酸酶和小眼相关转录因子表达的影响

张丽宏，安丽凤，黄敬文*，鲁光宝，刘海洲，王佳娜，王英莲，王兴焱

(黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的:在前期研究的基础上，以蒺藜皂苷为研究对象，考察其对A375细胞酪氨酸酶活性、TYR和MITF mRNA的表达的影响。方法:采用不同浓度的蒺藜皂苷作用于A375细胞48 h后，应用左旋多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，荧光定量PCR法检测A375细胞TYR和MITF mRNA的表达情况。结果:应用蒺藜皂苷处理后，酪氨酸酶活性均有不同程度的增加，当达到100 μg/mL和200 μg/mL时，有统计学差异。TYR和MITF mRNA的表达明显增强(P＜0.05)。结论:蒺藜皂苷可能通过增强A375细胞TYR和MITF mRNA的表达，以提高酪氨酸酶活性，促进黑素合成，从而为蒺藜皂苷的开发与应用奠定基础。

蒺藜皂苷;酪氨酸酶;MITF

白癜风(vitiligo)是世界性疑难杂症之一，属于色素减退性皮肤病，其皮损最初为小片色素减退或色素脱失的白斑，逐渐扩大或融合，甚至波及全身［1-3］。虽不危及生命，但给患者造成了严重的心理负担。中医药治疗白癜风，已有几千年的历史，取得了独特的疗效［4-5］。目前国内外众多学者热衷于治疗白癜风复方的组方规律研究，结果发现蒺藜是治疗白癜风各证型的常用中药，并居于前列。蒺藜为蒺藜科植物蒺藜(Tribulus terrestrisl)的果实，具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒等方面的功效，已开发成多种制剂，广泛应用于医学和保健领域。

本课题组前期研究中发现，一定浓度的蒺藜皂苷能够促进人黑素瘤A375细胞的增值、黏附，从而促进黑素合成，有望开发为治疗白癜风的中药制剂。但其是否通过干预酪氨酸酶(tyrosinase，Tyr)和小眼畸形相关转录因子(MITF)的表达来实现?本课题组就此问题进一步开展研究，从而阐明其作用机制，为后续开发和应用奠定基础。

1 实验材料

1.1 主要仪器

倒置显微镜(CKX41-A32PH，日本Olympus);全自动酶标仪(680，美国BIO-RAD);FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);超净工作台(SW-CJ-1F，苏州工业园区三兴净化科技有限公司);CO2培养箱(MCO-20AIC，日本三洋公司);Bio-Rad IQ5多色实时定量PCR检测仪(美国Bio Rod公司)。

1.2 试剂与药物

蒺藜皂苷(陕西森弗生物技术有限公司，纯度≥90%);DMEM培养基(GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季青公司);逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(Takara宝生物工程大连有限公司)。

1.3 细胞株

人黑素瘤A375细胞购自中科院上海生物细胞研究所。

2 方法

2.1 细胞株的培养

将人黑素瘤A375细胞复苏后，接种至无菌培养瓶中，DMEM培养液(内含1%青链霉素混合液，10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺)，调pH值7.2，放置于CO2培养箱内，隔日更换培养液，2～3天可传代1次。传代时，先弃掉培养液，再加入适量胰蛋白酶消化，消化完全后，加入含10%FBS的DMEM培养液，轻轻吹打至单细胞悬液。倒置显微镜下观察并计数，选择对数生长期的细胞用于实验。

2.2 分组及药物处理

实验共分5组，分别为蒺藜皂苷不同浓度组和空白对照组。蒺藜皂苷组需加入终浓度分别为25、50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液(实验前用DMEM培养液配置)。空白对照组给予相同体积的 DMEM培养液。

2.3 酪氨酸酶活性的测定

取对数生长期的人黑素瘤A375细胞，接种到96孔板内，每孔加入细胞密度为2×104个/ml的单细胞悬液200 μl，继续培养24 h后，更换培养液，蒺藜皂苷组分别加入终浓度50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液。空白对照组仅加入新鲜的DMEM培养液。置于培养箱继续培养48 h后，弃培养液，PBS漂洗2次，每孔再加入1%的Trion X-100溶液100 μl(PBS溶，pH值6.8)，快速于-80℃冷冻30 min，取出后置于室温缓慢溶解，37℃预温10 min后，每孔需再加入0.2%的左旋多巴溶液50 μl，反应1 h，离心后在酶标仪490 nm处测定吸光度值。每组设有6个复孔，测3次，最后取平均值。

2.4 实时荧光定量PCR测TYR和MITF mRNA表达

2.4.1 提取总RNA

将对数生长期的人黑素瘤A375细胞培养24 h后，更换培养液，蒺藜皂苷组分别加入终浓度50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液。空白对照组仅加入新鲜的DMEM培养液。再继续培养48 h后，分别收集细胞，提取总RNA(按Triozl抽提试剂说明书进行)，并进行总RNA纯度及浓度的测定。

2.4.2 引物序列

Genbank数据库中查找TYR和MITF mRNA全基因序列，应用Primer Premier5.0软件进行引物设计，引物序列见表1。

表1 TYR、MITF和β-actin引物序列

2.4.3 实时荧光定量多聚酶链反应

逆转录反应中cDNA的合成，按PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒反转录反应操作方法进行。PCR反应采用双标准曲线法，在荧光定量PCR仪上进行，反应条件:第一阶段是预变性，选择95℃预变性30 s，共1个循环;第二阶段是PCR反应，选择95℃变性5 s，然后60℃退火20 s，共40个循环。反应结束后，应用iQTM5软件分析各样本的Ct值。同时测定各样本的熔解曲线，由熔解曲线判断PCR反应的特异性。计算TYR和MITF mRNA的相对表达量，本实验重复3次。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 不同浓度蒺藜皂苷对酪氨酸酶活性的影响

不同浓度的蒺藜皂苷溶液处理A375细胞48 h后，将裂解细胞后所得的上清液进行处理，检测A375细胞被蒺藜皂苷诱导后，细胞中相对酪氨酸酶的活性。由表1可知，与对照组比较，给药组酪氨酸酶均有不同程度的增加，当达到100 μg/mL和200 μg/mL时，相对酪氨酸酶的活力分别为1.40和1.33，有统计学差异。

表2 The relatively total activity of tyrosinase of A375 treated with ASP(±s)

表2 The relatively total activity of tyrosinase of A375 treated with ASP(±s)

Note:To compare with the control group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.

Groups(μg/mL)Total activity of tyrosinases Multiple Control 0.089±0.025 1.00 25 0.099±0.032 1.11 50 0.112±0.033 1.25 100 0.125±0.035＊＊1.40 200 0.119±0.032*1.33

3.2 高浓度蒺藜皂苷对TYR和MITF mRNA表达的影响

3.2.1 总RNA、熔解曲线和标准曲线分析

提取A375细胞的总RNA，使用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值均大于1.8，符合反转录要求。Fig.1～3显示内参基因(β-actin)和目的基因(TYR、MITF)的熔解曲线皆为一个峰，峰形尖而窄，无杂峰，提示本实验可以保证扩增产物的特异性。Fig.4～6显示内参基因(β-actin)和目的基因(TYR、MITF)的标准曲线，图中显示直线拟合度良好，可在较宽的范围内进行定量分析。

3.2.2 高浓度蒺藜皂苷对A375细胞TYR和MITF mRNA的表达情况

将终浓度为100 μg/mL蒺藜皂苷作用于A375细胞48 h后，收集细胞并提取总mRNA，进行常规逆转录反应和荧光定量PCR检测TYR和MITF mRNA的表达情况。实验结果提示，100 ug/mL蒺藜皂苷能增强TYR和MITF mRNA的表达(P＜0.05)。具体见Fig.7。

4 讨论

白癜风是临床上色素减退性皮肤病中最常见的一种疾病，其病理特征为黑素细胞的选择性破坏引起黑素合成减少［6-7］。黑素的合成受多种因素的调控，酪氨酸酶是在黑素合成过程中发挥关键作用的酶［8-9］，MITF是关键的调控基因［10］。各种因素引起的人体黑素细胞酪氨酸酶活力下降、酪氨酸酶基因或MITF基因表达异常等均能降低黑素合成，从而导致色素减退性皮肤病。因此，改善酪氨酸酶活力、调控酪氨酸酶基因和MITF基因表达为众多学者提供了研究路径。

临床上蒺藜具有较强的祛风止痒的作用，在治疗白癜风方面取得独特的疗效，常与蝉蜕、荆芥等同用。但蒺藜的妙用在于对用量的掌握上，否则不会收到预期疗效。《中国药典》中记录其常规用量是6～9 g，但临床治疗白癜风时，所用的剂量大多超过了《中国药典》中的剂量。如刘复兴［11］将白癜风分为七个证型进行治疗，各型患者均使用了蒺藜，而且重用至60 g。

Fig.1 Melting curve of β-actin

Fig.2 Melting curve of TYR

Fig.3 Melting curve of MITF

Fig.4 Standard curve of β-actin

Fig.5 Standard curve of TYR

Fig.6 Standard curve of MITF

Fig.7 Effect of ASP on TYR and MITF mRNA expression in A375 cells

在实验中，不同浓度的蒺藜皂苷作用于A375细胞后，酪氨酸酶活性均有不同程度的增加，当达到100 μg/mL和200 μg/mL时，相对酪氨酸酶的活力分别为1.40和1.33，有统计学差异，说明高浓度蒺藜皂苷具有增强A375细胞酪氨酸酶活性的作用。为进一步深入研究其作用机制，课题组采用荧光定量PCR法检测A375细胞TYR和MITF mRNA的表达情况。实验结果显示，应用高浓度蒺藜皂苷处理后，A375细胞TYR和MITF mRNA的表达明显增强(P＜0.05)。这些实验结果提示高浓度蒺藜皂苷可能通过增强A375细胞TYR和MITF mRNA的表达，以提高酪氨酸酶活性，从而促进黑素合成。课题组下一步将通过动物实验和临床试验对实验结果做深入验证，以期为蒺藜皂苷的开发与应用提供全面而可靠的依据。

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Effect of Thistle Saponins on TYR and MITF mRNA Expressions of A375 Cells

ZHANG Li-hong，AN Li-feng，HUANG Jing-wen*，LU Guang-bao，LIU Hai-zhou，WANG Jia-na，WANG Ying-lian，WANG Xing-yan
(Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154007，China)

Objective:On the basis of the previous research，regarding thistle saponins as the research object，to study its tyrosinase activity，tyrosinase and MITF mRNA expressions of A375 cells.Methods:Different concentrations of thistle saponins were used for the A375 cells for 48 hours，and then the tyrosinase activity was evaluated by levodopa oxidation method.TYR and MITF mRNA expressions of A375 cells were detected by luorescence quantitative PCR.Results:After application of thistle saponins，the activity of tyrosine was increased to a certain degree.When it was up to 100 μg/mL and 200 μg/mL，there was a statistical significance.TYR and MITF mRNA expressions were obviously increased(P＜0.05).Conclusion:Thistle saponins can improve the activity of tyrosinase by enhancing TYR and MITF mRNA expressions of A375 cell，so as to promote the synthesis of melanin，which lay a foundation for the development and application of thistle saponins.

Thistle saponins;Tyrosinase(TYR);MITF

R28

A

1002-2406(2017)02-0018-04

黑龙江省青年科学基金项目(No.QC2012C004);黑龙江省教育厅科学技术项目(No.12531626);黑龙江省博士后资助课题(No.LBHZ13198)

张丽宏(1970-)，女，副教授，主要从事中医美容研究工作。

黄敬文*(1980-)，男，副教授，博士，主要研究方向:色素障碍性皮肤病的临床与基础研究。

2016-04-06

修回日期:2016-05-01