生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的保护作用

姜卫星，王海燕，索成云，张海峰，孙永新，吴丽宏，张艳庆

(1.冀中能源峰峰集团总医院，河北 邯郸 056200;2.邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的保护作用

姜卫星1，王海燕2，索成云1，张海峰1，孙永新1，吴丽宏1，张艳庆1

(1.冀中能源峰峰集团总医院，河北 邯郸 056200;2.邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

目的:研究生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的保护作用。方法:将120只SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、生姜醇提取物(100、200、400 mg/kg)组和金纳多;术前2周开始灌胃给药，每天1次;采用夹闭肝门静脉和肝动脉1 h后松夹的方法制备肝脏缺血再灌注大鼠模型。再灌注2 h后，测定肝脏组织中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;测定血清中总抗氧化能力(T-AOC)水平和转氨酶(ALT、AST)、乳酸脱氢酶(LDH)含量;HE染色法观察肝脏组织形态结构改变;TUNEL法观察肝细胞凋亡状况并计算凋亡指数(Apoptosis Index，AI);Western blotting法检测肝组织中NF-κB表达并进行半定量分析。结果:生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组大鼠肝脏组织中SOD和CAT活性较模型组显著升高，而MDA含量和血清中ALT、AST、LDH水平显著降低，其中400 mg/kg组GSH-Px活性和T-AOC水平均显著升高;生姜醇提取物各组大鼠肝脏组织形态结构改变和肝细胞凋亡状况较模型组均明显改善，均以400 mg/kg组效果最为显著;生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组肝细胞AI较模型组显著降低、NF-κB蛋白表达显著下调;上述差异均具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。结论:生姜醇提取物能够有效改善肝脏组织中抗氧化酶活性、抑制肝脏组织病变、改善肝功能、抑制肝细胞凋亡，提示生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注大鼠氧化应激损伤具有保护作用。

生姜醇提取物;肝脏;缺血再灌注;氧化应激

肝脏组织是血流量非常大的器官之一，因此肝脏手术过程中经常需要暂时阻断肝脏血流以减少出血，但恢复血流再通后所产生的再灌注损伤，将进一步损伤肝细胞，影响肝功能［1］。随着病理生理机制研究的深入，发现再灌注过程中所产生的大量氧自由基是造成再灌注损伤的重要因素［2］。生姜为姜科植物姜的新鲜根茎，性味辛温，具有解表散寒、温中止呕、行水解毒之功效，为我国临床广泛应用的传统中药。近年来研究发现，生姜具有良好的抗氧化活性［3］。本实验通过夹闭肝门静脉和肝动脉1 h后松夹的方法制备肝脏缺血再灌注大鼠模型，研究生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注后氧化应激损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验药物与试剂

生姜醇提取物(陕西旭煌植物科技有限公司，批号140728，以姜辣素计:纯度≥90%);金纳多(台湾济生化学制药厂股份有限公司，批号20141209);SOD、GSH-Px、CAT、MDA、T-AOC试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为 150416、150523、150129、141217、150419);ALT、AST、LDH试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号分别为150124002，150312011，150309007);HE染色试剂盒、TUNEL检测试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司，批号150316、150124);NF-κB单克隆抗体(批号150327，北京博奥森生物技术有限公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(批号150506，南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物

清洁级级SD大鼠(雄性，7周龄，体质量220～260 g)，购自河北省实验动物中心，许可证号:SCXK (冀)2013-1-003。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型制备

120只SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、生姜醇提取物(100、200、400 mg/kg)组和金纳多(4 mg/kg)组;术前2周开始灌胃给药，每天1次，假手术组和模型对照组同步给予等体积生理盐水。除假手术组外，其余各组大鼠均参照Taniguchi等［4］研究报道的方法制备大鼠肝脏缺血再灌注模型:使用无创动脉夹夹闭肝门静脉和肝动脉，1 h后恢复血流再灌注;假手术组行手术通路，但不阻断肝门静脉和肝动脉，其余操作同手术组;再灌注2 h后经腹主动脉取血，并取肝脏标本，保存待测。

1.3.2 肝脏组织中抗氧化酶活性和MDA含量的检测

取肝脏组织标本，剪碎后行研磨匀浆，3 000 rpm离心10 min后取上清液，严格按照试剂盒操作方法步骤，通过紫外-可见分光光度计测定各组大鼠肝脏组织中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和MDA含量。

1.3.3 血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量检测

取血液标本，经1 500 rpm离心10 min后取血清，按照各剂盒操作方法步骤，通过紫外-可见分光光度计测定血清中T-AOC水平并通过全自动生化检测仪测定ALT、AST和LDH含量。

1.3.4 肝脏组织形态结构改变、肝细胞凋亡状况的观察及AI的计算

取肝脏组织标本，经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片(厚度约5 μm)后，参照试剂盒步骤行HE染色，于倒置光学显微镜下观察肝脏组织病理形态学改变。取石蜡切片，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化、PBS浸洗、4%多聚甲醛固定15 min、PBS洗剂、去离子水冲洗、滴加100 μl TUNEL反应混合液于标本上(37℃暗湿盒中反应1 h)、终止反应、PBS 5min×3次、DAB避光显色后，通过光学显微镜观察细胞凋亡状况(细胞核黄染为阳性着色)。AI计算:每张染色切片随机选取6个视野，分别计数每个视野中细胞总数和阳性着色细胞数，各组分别取平均值，然后计算AI。

AI(%)=(阳性细胞数/细胞总数)×100%

1.3.5 肝组织中NF-κB表达的检测及半定量分析

取1.3.2制备的肝组织匀浆上清液，BCA法测定蛋白含量后进行后续反应，进行蛋白变性(90℃水浴10 min)、上样、10%SDS-PAGE恒压电泳(4℃，电压80 V，30 min)+分离胶(4℃，电压120 V，120 min)、转NC膜(转膜缓冲液中浸泡30 min)、印迹电转移(4℃，100 V，3.5 h)、春红溶液染色、室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4℃过夜、PBS溶液洗膜，二抗室温孵育1 h后，经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

1.4 统计学处理

运用统计学软件SPSS13.0对实验数据进行统计分析，计量资料以(±s)表示，各组间均数比较采用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验;P＜0.05表示差异具有统计学意义，P＜0.01表示具有极显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏组织中抗氧化酶活性和MDA含量比较

模型组大鼠肝脏组织中抗氧化酶(SOD、GSHPx、CAT)活性较假手术组显著降低且MDA含量显著升高(P＜0.01);生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组和金纳多组SOD、CAT活性较模型对照组均显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，MDA含量显著降低(P＜0.01)，并且400 mg/kg预处理组 GSH-Px活性显著升高(P＜0.01)，结果见表1。

表1 各组大鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比较(±s)

表1 各组大鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比较(±s)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 n SOD(U/mg prot) GSH-Px(U/mg prot) CAT(U/mg prot) MDA(nmol/mg prot)假手术组10 13.2±2.8 18.9±3.5 4.0±0.7 3.4±0.8模型组 10 6.4±2.0△△9.7±2.4△△2.3±0.5△△9.3±2.2△△生姜醇提取物100 mg/kg组 10 7.0±2.3 10.5±2.7 2.8±0.7 8.2±2.5生姜醇提取物200 mg/kg组 10 8.5±2.7*11.4±3.3 3.1±0.8*5.7±1.9＊＊生姜醇提取物400 mg/kg组 10 10.3±3.1＊＊13.1±3.7＊＊3.5±0.7＊＊4.8±1.6＊＊金纳多4 mg/kg组 10 9.1±2.9*11.2±3.1 3.0±0.6*6.1±1.8*

2.2 各组大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比较

模型组大鼠血清中T-AOC水平较假手术组显著降低(P＜0.01)，ALT、AST、LDH含量显著升高(P＜ 0.01);生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组和金纳多组ALT、AST、LDH含量较模型组显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中400 mg/kg组 T-AOC水平显著升高(P＜0.05)，结果见表2。

表2 各组大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比较(±s)

表2 各组大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比较(±s)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 n T-AOC(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) LDH(U/L)假手术组10 11.8±1.3 109.3±12.4 51.6±4.2 572.4±76.3模型组 10 6.2±0.9△△1270.4±142.5△△947.2±125.3△△1193.5±142.1△△生姜醇提取物100 mg/kg组 10 7.1±1.1 814.3±153.7*803.5±120.9 967.0±122.9生姜醇提取物200 mg/kg组 10 7.9±1.4 596.2±92.6＊＊562.8±109.6*822.9±98.7*生姜醇提取物400 mg/kg组 10 8.6±1.7*417.5±80.1＊＊397.4±121.3＊＊754.8±81.6＊＊金纳多4 mg/kg组 10 7.5±1.5 604.9±128.0＊＊580.3±103.5*816.5±102.2*

2.3 各组大鼠肝脏组织细胞病理性形态学改变

假手术组大鼠肝脏组织结构及肝细胞形态均未见异常;模型组大鼠肝脏组织结构呈现肝组织纹理不清、肝窦充血、部分肝小叶结构模糊，肝细胞呈空泡变性和坏死、胞核固缩并深染等明显的病理性形态结构改变;生姜醇提取物各组和金纳多组肝脏组织病理性形态结构改变呈不同程度改善，以生姜醇提取物400 mg/kg组效果最为显著，见图1。

2.4 各组大鼠肝细胞凋亡状况及AI

经TUNEL染色后观察发现，假手术组大鼠肝脏组织仅存在极少量凋亡细胞，模型组凋亡细胞数量较假手术组明显增多;与模型组比较，生姜醇提取物各组细胞凋亡状况明显好转，以400 mg/kg组效果最为显著，见图2。计算AI发现:模型组大鼠肝脏细胞AI较假手术组显著升高(P＜0.01)，而生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组和金纳多组AI较模型对照组均显著降低(P＜0.01)，结果见表3。

图1 各组大鼠肝脏组织病理性形态学改变(HE，×400)

图2 各大鼠肝脏细胞凋亡状况比较(TUNEL，×400)

2.5 各组大鼠肝组织NF-κB蛋白表达

通过Western blotting检测并进行半定量分析发现:模型对照组大鼠肝组织中NF-κB蛋白表达较假手术组显著上调(P＜0.01);而生姜醇提取物(200、400 mg/kg)组和金纳多组NF-κB蛋白表达较模型组显著下调(P＜0.05，P＜0.01)，结果见图3和表3。

图3 各组大鼠肝组织NF-κB蛋白表达量的变化

表3 各组大鼠肝组织细胞凋亡指数及NF-κB蛋白表达量(±s)

表3 各组大鼠肝组织细胞凋亡指数及NF-κB蛋白表达量(±s)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 n AI(%) NF-κB/β-actin假手术组10 2.3±1.5 0.15±0.04模型组 10 38.5±7.2△△0.42±0.13△△生姜醇提取物100 mg/kg组 10 29.1±6.6 0.37±0.12生姜醇提取物200 mg/kg组 10 23.4±5.0＊＊0.32±0.09*生姜醇提取物400 mg/kg组 10 14.2±3.7＊＊0.26±0.08＊＊金纳多4 mg/kg组 10 25.1±5.4＊＊0.30±0.10*

3 讨论

肝脏是对氧非常敏感的器官，低血容量性休克以及肝脏手术过程中暂时阻断肝脏血流，均会导致急性缺血再灌注损伤。随着病理生理机制研究的深入，发现随着氧的涌入，氧自由基的大量生成和过剩，进而诱发的氧化应激损伤是导致肝脏缺血再灌注损伤非常重要的病理机制之一［5］。张琳［6］和李伟等［7］通过药物干预肝脏缺血再灌注损伤大鼠模型发现，抑制氧化应激损伤能够有效降低肝脏缺血再灌注损伤。

氧自由基过剩是导致机体氧化应激损伤的病理基础，正常生理状态下，体内氧自由基能够在SOD催化作用下还原生成过氧化氢［8］并在GSH-Px或CAT的催化作用下进一步还原生成对人体无害的水和氧［9-10］，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能够反映机体抗氧化能力;T-AOC水平能够反映机体抗氧化能力;而MDA为机体脂质过氧化终产物，其含量水平能够间接反映机体氧化应激损伤程度。ALT、LDH主要存在于肝细胞胞浆中而AST主要存在于肝细胞线粒体中，它们在血清中的含量是反映肝功能最重要、最敏感的指标;正常生理状态下它们的含量都非常低，而当细胞膜系统受氧自由基攻击而受损后将迅速释放入血，导致血清中含量陡然增高，所以血清中ALT、AST和LDH含量水平能够非常敏感的反应肝脏组织受损伤程度。

细胞凋亡是一种继发性行为，而氧化应激损伤是其非常重要的诱发因素［11-13］，因此细胞凋亡状况也能间接反映机体氧化应激损伤程度。NF-κB为多效能核转录因子，常态下NF-κB以无活性形式存在于胞质中，而当细胞受到外界因素刺激时，NF-κB将被激活并参与调控靶基因的转录和表达。张楷等［14］通过动物实验研究发现，NF-κB激活在氧化应激诱导细胞凋亡过程中发挥着关键作用。

生姜为姜科植物姜的新鲜根茎，为我国传统中药之一，其提取物具有良好的抗氧化活性。本研究采用夹闭肝门静脉和肝动脉1 h后松夹的方法制备肝脏缺血再灌注大鼠模型，研究生姜醇提取物对肝缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的保护作用，发现生姜醇提取物能够有效改善肝脏组织抗氧化酶活性、减轻脂质过氧化损伤、抑制肝脏组织病变、改善肝功能，提示生姜醇提取物对肝脏缺血再灌注损伤大鼠氧化应激损伤具有保护作用。

［1］Abu-Amara M，Yang SY，Tapuria N，et al.Liver ischemia/reperfusion injury:processes in inflammatory networks-a review［J］.Liver Transpl，2010，16:1016-1032.

［2］李一宁，李涛，齐海智.米诺环素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用［J］.中南大学学报(医学版)，2014，39(11):1137-1144.

［3］王桥，宋学英，朱莹，等.生姜醇提取物抗氧化与抗缺氧作用的研究［J］.中国中药杂志，2003，28(6):551-552.

［4］Taniguchi M，Uchinami M，Doi K，et al.Edaravone reduces ischemia reperfusion injury mediators in rat liver［J］.J Surg Res，2007，137 (1):69-74.

［5］Kawamura E，Yamakana N，Tomoto F，et al.Response of plasma and tissue endothelin-1 to liver ischemia and its implication in ischemiareperfusion injury［J］.Hepatology，1995，21(4):1138-1143.

［6］张琳，买买提祖农·买苏尔，袁一木，等.葡萄籽原花青素对大鼠肝缺血再灌注损伤的抗氧化作用研究［J］.新疆医科大学学报，2010，33(2):121-123.

［7］李伟，陆晓华，赵雪，等.核黄素预处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤［J］.中国病理生理杂志，2012，28(7):1314-1318.

［8］Wided K，Hassiba R，Mesbah L.Polyphenolic fraction of algerian propolis reverses doxorubicin induced oxidative stress in liver cells and mitochondria［J］.Pak J Pharm Sci，2014，27(6):1891-1897.

［9］Sairam RK，Singhd V，Srivaatava GC.Changes in activities of antioxidant enzymes in sunflower leaves of different age［J］.Biol Plant，2003，47(1):61-66.

［10］Ogunro PS，Olujombo FA，Ajala MO，et al.The effect of a membrane dialyzer during hemodialysis on the antioxidant status and lipid peroxidation of patients with end-stage renal disease［J］.Saudi J Kidney Dis Transpl，2014，25(6):1186-1193.

［11］陈良金，石孟琼，贺海波，等.珠子参总皂苷对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2012，17(8):860-867.

［12］李兵.丹参多酚酸盐对过氧化氢所致乳鼠心肌细胞损伤保护作用的研究［J］.中医药信息，2016，33(5):7-11.

［13］葛鹏玲，赵静，阑玉娜，等.花旗泽仁对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠氧化应激的影响［J］.中医药信息，2014，31(5):1-4.

［13］张楷，吴浩荣.褪黑素对缺血再灌注后大鼠肝脏NF-κB表达及肝细胞凋亡的影响［J］.江苏医药，2006，32(10):957-959.

Protective Effect of Ethanol extract of Zingiber Officinale on Oxidative Stress after Hepatic Ischemia-reperfusion in Rats

JIANG Wei-xing1，WANG Hai-yan2，SUO Cheng-yun1，ZHANG Hai-feng1，SUN Yong-xin1，WU Li-hong1，ZHANG Yan-qing1
(1.General Hospital of Fengfeng Group，Handan 056200，China;2.Handan Central Hospital，Handan 056001，China)

Objective:To investigate the protective effect of ethanol extract of zingiber officinale on oxidative stress after hepatic ischemia-reperfusion in rats.Methods:120 rats were randomly devided into six groups: sham operation group，model group，ethanol extract of zingiber officinale 100，200，400 mg/kg groups and Ginaton 4mg/kg group.Two weeks before operation，the drugs were given by intragastric administration，once a day.Two hours after reperfusion，the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in hepar were determined;the level of T-AOC and the content of ALT，AST，LDH in serum were determined;the histopathological changes and hepatocyte apoptosis were observed，and the apoptosis index(AI)was calculated;the expression of NF-κB protein was detected by Western blotting and semi-quantitative analysis.Results:Compared with the model group，the activities of SOD，CAT in hepar of ethanol extract of zingiber officinale 200，400 mg/kg groups were significantly increased;the contents of MDA in hepar and the content ofALT，AST，LDH in serum were significantly decreased;the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in 400 mg/kg group were significantly increased;the histopathological changes and the hepatocyte apoptosis were significantly improved compared with those of model group;the AI of 200，400 mg/kg groups was significantly decreased(P＜0.01);the expression of NF-κB proten was significantly down-regulated.All of the above differences were significant(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:Ethanol extract of zingiber officinale can effectively improve the activity of antioxidase，inhibit the histopathological changes，improve hepar function，depress hepatocyte apoptosis，suggesting that ethanol extract of zingiber officinale has a protective effect on oxidative stress after focal hepatic ischemia-reperfusion in rats.

Ethanol extract of zingiber officinale;Hepar;Ischemia-reperfusion;Oxidative stress

R285.5

A

1002-2406(2017)02-0009-05

邯郸市科学技术研究与发展计划项目(No.1623208094ZC)

姜卫星(1978-)，男，硕士，主治医师，主要从事外科疾病研究工作。

2016-07-19

修回日期:2016-08-10