赤芍对LPS诱导急性肺损伤大鼠的预防作用

韩文杰，王晴，张旗，丁楠，高菁，陈丹阳，李强

(北京中医药大学，北京 100102)

赤芍对LPS诱导急性肺损伤大鼠的预防作用

韩文杰，王晴，张旗，丁楠，高菁，陈丹阳，李强*

(北京中医药大学，北京 100102)

目的:探讨赤芍不同给药剂量对大鼠脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的预防作用，筛选最佳给药剂量，为后期药效物质基础研究奠定基础。方法:SD大鼠随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药(DEX)组、模型组(LPS组)、空白组(NS组)，每组10只。采用气管内滴注内毒素方法［1］建立急性肺损伤模型，造模12h后取肺灌洗液检测白细胞数目、蛋白浓度，取右肺上叶测湿干比，取右肺下叶观察肺组织病理形态学变化。结果:地塞米松、赤芍高中剂量给药组均能显著减少白细胞数目(P＜0.05)，降低肺湿干比(W/D)(P＜0.05)和蛋白浓度(P＜0.05)，缓解肺水肿、肺泡结构破坏、炎性细胞浸润，改善肺内出血情况。结论:赤芍能显著改善肺部结构受损、肺水肿、中性粒细胞浸润等病变，尤其以中剂量为佳。

赤芍;急性肺损伤;内毒素

急性肺损伤(ALI)是肺部的严重无序状态，死亡率较高，每年都造成约0.175%的人死亡。ALI的标志包括肺泡-毛细血管屏障的破坏，肺水肿外渗进入血管间隙和肺泡内白细胞浸润。而当氧合指数恶化到低于200的PaO2/FiO2浓度时将会引发急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］。ARDS的突出的临床特征描述为严重的呼吸困难，呼吸急促，肺顺应性下降和弥漫胸部X光浸润。组织病理学变化包括间质和肺泡出血和水肿，肺泡中出现大量巨噬细胞，但最突出的表现为透明膜的存在［2］。急性肺损伤还是多器官障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要组成部分，致死率极高。急性肺损伤的发病机理十分复杂，目前国内外专家并没有能力对其完全阐述。目前认为，肺内过度的失控性炎症反应是导致各种病因ALI的根本原因［3］。

赤芍为清热凉血的代表药物，含有多种化学成分，具有清热凉血、散瘀镇痛之功效。近年来，有关赤芍的研究不少［4-5］，但是对其作用的最佳给药剂量及药效物质基础的研究未见报道。本文从筛选最佳剂量入手，探讨不同给药剂量对ALI的干预作用，以期确定最佳给药剂量，为后期药效物质基础的研究做好铺垫，并最终开发出治疗急性肺损伤的理想药物，更好地应用于临床。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD大鼠，雄性70只，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:11400700036742。

1.1.2 试剂及主要仪器

赤芍药材购自河北安国药材市场(批号20151123)，经北京中医药大学生鉴定系刘春生教授鉴定为毛茛科植物赤芍的干燥根;大肠杆菌内毒素(L2880，sigma);牛血清白蛋白(A7030，PH -7，sigma);地塞米松注射液(批号1507111);吉姆萨染液(北京博奥拓达科技有限公司);考马斯亮蓝G-250 (北京拜尔迪生物科技有限公司);TXD型离心甩片机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);MK3型酶标仪(赛默飞仪器有限公司);Effendorf5810R离心机(德国);血液分析仪、Bx40F4型光学显微镜(OLYMPUS，日本);AxioCam ERC5s成像系统(德国蔡司数码成像系统)。

1.2 实验方法

1.2.1 赤芍水提物制备

赤芍药材，10倍量水，回流提取3次，每次1 h，四层纱布过滤，合并滤液，减压浓缩得到赤芍水提物高中低3种剂量，含生药量分别为1 ml≈1 g，1 ml≈0.5 g，1 ml≈0.17 g。

1.2.2 内毒素性急性肺损伤(ALI)模型制备

将大鼠随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药(DEX)组、模型组(LPS组)、空白组(NS组)。动物正常饲养两天后灌胃，分别灌胃三种赤芍水提物，每日1次，每次9 ml/kg，共计5天。造模前1 h，再灌胃1次，阳性药组注射地塞米松注射液2 mg/kg。造模前，各组均用水合氯醛(4 mg/kg)麻醉，预防给药组、阳性药组、模型组气管内滴注内毒素(LPS，5 mg/kg)，空白组在同样条件下，气管内滴注等体积的生理盐水。造模12 h后各组动物均取材。

1.3 指标检测

各组动物按照造模时间以腹主动脉取血处死后，剪开颈、胸部皮肤，分离气管，行气管插管。右支气管结扎，用磷酸缓冲液(PBS)6 mL分3次进行左肺灌洗(灌洗时保证每次打入、吸出等体积的液体)，收集肺泡灌洗液(BALF)4.5 ml，离心(4℃，1 300 r/min，10 min)。

1.3.1 BALF中蛋白含量测定

取离心后上清液，考马斯亮蓝法测定BALF中蛋白含量。以牛血清白蛋白(BSA)做标准曲线，100 !g/ml考马斯亮蓝G-250染液加入待测稀释液或蛋白标准液(v∶v=5∶1)，涡旋仪振匀后20℃ ～25℃放置15 min，加入96孔板。充分反应后，以考马斯亮蓝G-250染液作为调零孔，于酶标仪595 mn处测吸光度，根据蛋白质标准曲线计算BALF中的蛋白含量。

1.3.2 肺湿干比(W/D)

收集灌洗液后，取右肺上叶，称量湿重(W)，80℃烘干至恒重，称取干重(D)，计算湿干比(W/D)。

1.3.3 BALF中白细胞计数

用500 μl磷酸盐缓冲液(PBS)重旋沉淀，吹打均匀。取400 μl于血液分析仪中检测白细胞(WBC)数目。剩余100 μl混合液加入400 μl PBS，混匀。取100 μl于离心甩片机中离心做细胞涂片，吉姆萨(Gemsa)染色15 min，洗片，无水乙醇固定，中性树胶封片，于显微镜下观察细胞形态。

1.3.4 肺组织病理形态学观察

取右肺下叶，10%中性福尔马林固定48 h，流水冲洗12 h，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(Hematoxylinand Eosin，HE)染色，封片，光镜下病理观察。

1.4 统计学处理

采用SAS统计软件进行统计，计量资料以均数±标准差表示，单因素方差分析检验，组间两两比较采用LSD方法。

2 实验结果

2.1 各组白细胞(WBC)统计结果

LPS组BALF中WBC数目明显高于NS组(P＜0.05)，显示造模成功;与模型组相比，DEX组、高剂量组、中剂量组 WBC数目较 LPS组明显降低(P＜0.05)，低剂量组WBC与LPS组比较并无明显差异。结果说明LPS诱导炎性细胞的聚集活化，低剂量给药组并不能显著降低炎性细胞数量，高剂量组及中剂量组均能减少炎性细胞数量，但两者预防作用并无显著差异，中剂量组相比高剂量组疗效作用稍明显。各组白细胞数目见表1。

表1 各组白细胞(WBC)数目(±s，n=6)

表1 各组白细胞(WBC)数目(±s，n=6)

注:与空白组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05。

组别 WBC(109个/L)高剂量组 50.15"10.91*中剂量组 42.87"6.93*低剂量组 65.87"6.10 DEX组 18.43"3.83*LPS组 71.80"10.60#NS组 5.94"0.65

2.2 各组Gimsa染色细胞形态及数目观察

空白组中细胞结构完整，未见多形核白细胞及巨噬细胞浸润现象，视野范围内可见细胞数目较少。模型组与空白组相比，细胞数目大量增多，多形核白细胞及巨噬细胞大量浸润，出现炎症的明显迹象，说明模型成功。三个给药组与LPS组比较均能减少炎性细胞的数目，说明赤芍对于LPS诱导的炎症反应有一定预防作用，而且中剂量组预防作用强于其他两剂量组。结果见图1(×100)及图2(×400)所示。

图1 各组PMN图涂片显微镜观察(Gemsa染色，×100)

图2 各组PMN图涂片显微镜观察(Gemsa染色，×400)

2.3 各组肺W/D ratio变化

肺W/D ratio用来评价肺水肿的严重程度。与正常组相比，模型组W/D ratio显著升高(P＜0.05)，阳性药组可显著降低W/D ratio(P＜0.05)。三个给药组W/D ratio均与模型组有显著差异，中剂量组降低作用最明显。结果说明LPS能引起肺泡通透性增加，造成肺损伤，而高、中、低三组预防给药组均能减低肺水肿严重程度。结果见表2所示。

表2 不同给药剂量各组W/D ratio(±s，n=6)

表2 不同给药剂量各组W/D ratio(±s，n=6)

注:与空白组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05。

组别W/D ratio高剂量组 4.57"0.04*中剂量组 4.54"0.06*低剂量组 4.66"0.03*DEX组 4.31"0.11*LPS组 4.77"0.09#NS组 4.39"0.07

2.4 各组蛋白浓度变化

LPS组蛋白浓度相比空白组明显升高(P＜0.05)，高剂量组、中剂量组蛋白浓度均比模型组显著降低(P＜0.05)，且两组作用并无显著性差异。低剂量组蛋白浓度与模型组无明显差异。模型组大鼠BALF中蛋白含量急剧增多，说明LPS刺激后大鼠肺泡通透性增加，炎性反应加重，肺损伤较严重。而高、中预防给药组均可以预防肺水肿，低剂量组对于LPS引起的炎性反应无显著改善作用。结果如表3显示。

表3 不同给药剂量各组蛋白浓度(±s，n=6)

表3 不同给药剂量各组蛋白浓度(±s，n=6)

注:与空白组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05。

组别 蛋白浓度(μg/ml)高剂量组 200.81"16.59*中剂量组 196.60"10.96*低剂量组 228.97"9.41 DEX组 177.03"4.55*LPS组 240.50"13.73#NS组 101.40"17.72

2.5 肺组织病理形态学考察

NS组中肺泡结构完整，大小均匀，肺泡腔清晰、壁薄。大鼠肺组织中LPS组表现特征性病理改变的迹象，包括间质性水肿，肺充血，肺泡壁和渗透增厚，炎性细胞浸润，肺泡塌陷和纤维化。LPS诱导的病理变化被高、中剂量组显著减弱，低剂量组与模型组并无显著差异。结果见图3。

图3 各组肺组织病理形态学观察(HE染色，×100)

3 讨论

目前多数学者认为，参与炎症反应的细胞主要有多形核白细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等。活化的多形核白细胞会引发呼吸大爆发并释放大量炎性介质及细胞因子，损伤肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞，导致肺水肿和肺换气功能障碍。大量炎症介质及炎症细胞构成炎症反应和免疫调节的“细胞网络”和“细胞因子网络”，并通过NF-κB、p38丝裂霉素原活化蛋白激酶等信号通路调控机体炎症反应［6-8］。

根据ALI所引起的临床表现，一般认为多属中医的“暴喘”“结胸”“喘脱”等病证范围［9］，叶天士《温热论》中提出卫气营血辨证，《温病条辨·上·十一》:“太阴温病，血从上溢者，犀角地黄汤……”提出血从上溢，肺之化源速竭的温病第一死症，在病因病机和临床表现上均符合现代医学 ARDS的临床特征［10］。SARS、流感等重大疫情，也属中医温病学范畴。赤芍出现在很多经方里，如《清瘟败毒饮》《犀角地黄汤》等，专于凉血解毒化瘀。陈畅等［11］研究发现，赤芍能抑制LPS诱导的中性粒细胞和巨噬细胞在肺内的聚集，减少肺血管内皮的伤害，抑制肺组织iNOS异常高表达，减少NO的生成和释放，进而减轻肺组织脂质过氧化损伤。

以上结果显示，赤芍高、中预防给药组均能明显减少白细胞数目、肺湿干比、蛋白浓度及降低肺组织病理程度，说明赤芍可以预防由LPS引起的中性粒细胞、巨噬细胞等的炎性细胞浸润、减轻肺水肿、减少肺血管内皮细胞的损害，低剂量组不能显著减轻以上症状。综合以上指标，中剂量为最佳给药剂量，对预防急性肺损伤作用明显。为进一步研究赤芍作用于大鼠急性肺损伤的药效物质及作用机制奠定坚实的基础，具有一定的参考价值。

［1］Mutz C，V Mirakaj，Vagts DA，et al.The neuronal guidance protein netrin-1 reduces alveolar inflammation in aporcine model of acute lung injury［J］.Critical care，2010，14(5):189.

［2］Costa EL，Amato MB.The new definition for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome:is there room for improvement?［J］.Current Opinion in Critical Care，2013，19(1):16-23.

［3］洪辉华，蔡宛如.急性肺损伤的发病机制及中医药治疗的实验研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2007，31(1):33-135.

［4］李颖.不同剂量赤芍对马钱子增效减毒作用影响的实验研究［J］.中医药学报，2015，43(6):39-41.

［5］吴修红，杨东霞，杨波，等.大孔树脂纯化赤芍中芍药苷的工艺研究［J］.中医药学报，2012，40(1):74-75.

［6］刘家昌，孙燕妮，彭屹峰，等.益气补肾活血方对佐剂关节炎大鼠JNK和P38MAPK的影响［J］.中医药信息，2016，33(5):39-42.

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［9］耿耘，魏星.急性呼吸窘迫综合征的中医发病机理探讨［J］.江西中医药，2002，33(5):11-12.

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［11］陈畅，夏中元，孟庆涛.赤芍对大鼠内毒素性急性肺损伤保护作用机制的研究［J］.中国急救医学，2005，25(1):41-43.

Preventive Effect of Radix Paeoniae Rubra on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury in Rats

HAN Wen-jie，WANG Qing，ZHANG Qi，DING Nan，CAO Jing，CHEN Dan-yang，LI Qiang*
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective:To probe the preventive effect of different doses of Paeoniae Rubra Radix on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats，filtering the optimal dose and speculating the possible mechanism.Methods:SD rats were divided into a high dose group，a middle dose group，a low dose group，a positive drug group(DEX group)，a model group(LPS group)and a control group(NS group)，with 10 rats in each group.The model group was established by intratracheal administration of lipopolysaccharide.12 h later detect the number of white blood cells，protein concentration from the lung lavage fluid and measure wet weight and dry weight of upper lobe of the right lung and observe pathological changes of lower lobe of the right lung.Results:Dexamethasone，the high dose group and the middle dose group could significantly reduce the number of white blood cells(P＜0.05)，reduce lung wet to dry ratio(W/D)(P＜0.05)and protein concentration (P＜0.05)，relieve pulmonary edema，alveolar structural damage and inflammatory cell infiltration and reduce pulmonary hemorrhage.Conclusion:Radix paeoniae rubra can relieve the acute lung injury induced by lipopolysaccharide and the middle dose is the optimal.

Radix paeoniae rubra;Acute lung injury;Lipopolysaccharide

R285.5

A

1002-2406(2017)02-0014-04

韩文杰(1993-)，女，北京中医药大学2014级中药学专业科硕研究生。

李强*(1972-)，男，研究员，硕士研究生导师，主要研究方向:中药药效物质基础及功效成分组研究。

2016-06-21

修回日期:2016-07-01