瘤果黑种草子总黄酮对RAW264.7细胞及豚鼠气管平滑肌的作用

曹 园，耿东升，孙玉华，袁凤娟

（1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000； 2.中国人民解放军新疆军区联勤部药品仪器检验所，新疆 乌鲁木齐 830063；3.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004）

·实验研究·

瘤果黑种草子总黄酮对RAW264.7细胞及豚鼠气管平滑肌的作用

曹 园1，耿东升2，孙玉华3，袁凤娟1

（1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000； 2.中国人民解放军新疆军区联勤部药品仪器检验所，新疆 乌鲁木齐 830063；3.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004）

目的探讨瘤果黑种草子总黄酮(TFNG)对 RAW264.7细胞及豚鼠气管平滑肌的作用。方法 采用酶联免疫吸附法（ELISA）、Griess Reagent法检测高、中、低剂量（20，40，80 g／mL）TFNG对脂多糖（LPS）体外诱导的RAW264.7细胞分泌白细胞介素8（IL－8）、IL－6、一氧化氮(NO)的影响；采用离体气管恒温灌流的方法，制备豚鼠气管螺旋条标本，通过观察其张力变化考察1，2，4 g／L不同剂量TFNG和10 g／L水煎液对张乙酰胆碱（ACh）和组胺（His）所致痉挛离体豚鼠气管平滑肌解痉作用。结果TFNG低于100 g／mL时对RAW264.7细胞无明显的毒性作用；与LPS组比较，TFNG低、中、高剂量（20，40，80 g／mL）均能抑制RAW264.7细胞过量分泌IL－6，IL－8，NO（P＜0.05），且呈一定量效关系；TFNG低、中、高剂量组（1，2，4 g／L）可明显舒张ACh及His引起的豚鼠支气管平滑肌痉挛，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 TFNG具有一定的体外抗炎及支气管解痉功能。

瘤果黑种草子总黄酮；巨噬细胞；支气管解痉；抗炎；豚鼠

瘤果黑种草属毛茛科黑种草属金莲花亚科植物，为我国新疆维吾尔族常用药材[1]。本课题的前期研究显示，瘤果黑种草子提取物中总黄酮(total flavones from Nigella Glandulifera，TFNG)，可明显减轻慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺部炎性细胞浸润，延长引起小鼠哮喘反应的潜伏期，有一定的平喘作用[2－3]。但 TFNG对炎性反应中巨噬细胞炎症因子表达的影响及支气管平滑肌解痉作用机制报道少见。本试验旨在进一步研究TFNG对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7分泌炎症因子水平的影响，以及乙酰胆碱（acetylcholine chloride，ACh）和组胺（histamine，His）引起的豚鼠支气管平滑肌痉挛的作用，为慢性阻塞性肺疾病后期的药物研究提供理论基础和实验室依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 动物

健康豚鼠，体质量350～450 g，雌雄各半，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，实验动物质量合格证号65000200000453，生产许可证为SCXK＜新＞2011－0001）。动物饲养在SPF级动物房，至少饲养1周后再使用；温度为(22±1)℃，相对湿度为(55±5)%，12 h光暗循环；饲料和水均在消毒后由动物自由摄取；所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

1.1.2 药物

瘤果黑种草子 Nigella Glandulifera Freyn购自新疆和田墨玉县，经新疆中药民族药研究所李晓瑾研究员鉴定为 Nigella Glandulifera Freyn的种子，批号为201404；TFNG粉末由瘤果黑种草子采用40%乙醇回流提取，大孔树脂分离及聚酰胺树脂纯化而得，TFNG质量分数为58%。

1.1.3 试剂

脂多糖(LPS，美国Sigma公司）；噻唑蓝（MTT，美国Amresco公司）；RPMI1640培养液（美国HyClone公司）；白细胞介素6（IL－6）；酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒(美国eBioscience公司)；IL－8 ELISA试剂盒（购自 Cloud－clone corp公司）；胎牛血清（美国 Gibco公司）；一氧化氮检测试剂盒（Promega公司）；ACh（美国Sigma公司，货号为A2661－25G，批号为BCBM4814V）；His（美国 Sigma公司，货号为 V900396－1G，批号为WXBB2337V）；氨茶碱注射液（常州兰陵制药有限公司，国药准字H32025188，批号为11409051）。

1.1.4 细胞株

小鼠单核／巨噬细胞株RAW264.7，购于北京协和细胞资源中心。

1.1.5 仪器

BPN－CH型CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DSY2000X型倒置荧光显微镜（重庆澳浦光电技术有限公司）；TDZ5－WS型多管架自动平衡离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；RT－6100型酶标仪（深圳雷杜生命科学仪器有限公司）；BL－410F型生物机能实验系统，HV－4型离体组织器官恒温灌流系统，HW－1000型超级恒温水浴（成都泰盟科技有限公司）。1.2 方法

1.2.1 LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子影响试验[4]

采用MTT法检测TFNG对RAW264.7细胞活性的影响。分别设 TFNG组（100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg／mL）、LPS组、空白对照组，每组设置3个平行孔，用二甲基亚砜（DMSO）助溶。空白对照组加入培养液，LPS组加入等量含0.5 μg／mL LPS的培养液。培养箱内孵育24 h后每孔加入5 g／L的MTT溶液20 μL，避光培养4 h后吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于室温下振荡10 min，于595 nm波长处检测各孔的吸光度，计算细胞存活率。

检测TFNG对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌IL－8，IL－6，NO[5]。采用ELISA检测IL－8及IL－6的水平，采用Griess法检测NO的水平。设空白对照组、LPS组、水煎液组和 TFNG低、中、高剂量组（20，40，80 μg／mL），每组设置3个平行孔。空白组加入培养液，TFNG组、水煎液组于加药4 h后加入0.5 μg／mL的LPS，LPS组加入等量含0.5 μg／mL的LPS培养液。培养箱内孵育24 h后吸取上清液分装，检测。

1.2.2 豚鼠离体支气管解痉试验[6]

取体质量为350～400g的豚鼠36只，随机分为9组，雌雄各半，每组4只，分别为生理盐水组，阳性对照组（氨茶碱 0.008 g／L），水煎液对照组 （10 g／L），TFNG低、中、高剂量组（1，2，4 g／L）。试验前，用木棒击昏豚鼠，颈动脉放血致死，分离并取出气管，仔细剔除气管周围结缔组织，放入饱和混合气体（95%O2＋5%CO2）的K－H液(NaCl 6.9 g／L，KCl 0.35 g／L，KH2PO40.16 g／L，NaHCO32.1 g／L，MgSO40.28 g／L，CaCl20.28 g／L，葡萄糖2 g／L，pH＝7.2)中。每3～4个软骨环切一个螺旋条标本，每个气管段制成3条标本，标本放在浴槽内，每个浴槽内加入10 mL(37±0.5)℃恒温的K－H液，标本的一端固定于浴槽底部，另一端连接于肌张力换能器上，浴槽内通入混合气体，打开BL410型生物机能实验系统，调整平滑肌条初负荷为1.7 g，记录一段气管平稳活动的曲线，然后开始给药。浴槽内加入10 μL终质量浓度为1×10－7g／mL的ACh（或终质量浓度为1×10－6g／mL的 His），待作用明显时加入各组药物100 μL，生理盐水组注入等量生理盐水。给药后记录气管平滑肌张力的变化，用K－H液冲洗，气管平滑肌恢复平稳后再加入另一种药物。计算解痉率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示。单因素方差分析进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对RAW264.7细胞活性的影响

由表 1可见，6.25～100.00 μg／mL的 TFNG对RAW 264.7细胞活性无明显影响。因此，本试验选用的药物剂量分别为20，40，80 μg／mL。

表1 细胞活性检测结果（n＝4）

2.2 对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

LPS组与空白对照组比较，IL－8，IL－6，NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），表明建模成功。与LPS组相比，TFNG高、中、低剂量组IL－8，IL－6，NO含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

2.3 豚鼠离体支气管解痉试验

与生理盐水组比较，阳性对照组、水煎液对照组及TFNG低、中、高剂量组解痉率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表3和表4。

表2 TFNG对RAW264.7细胞分泌IL－8，IL－6，NO的影响（±s，n＝3）

表2 TFNG对RAW264.7细胞分泌IL－8，IL－6，NO的影响（±s，n＝3）

注：与LPS组比较， P＜0.01， P＜0.05；与空白对照组比较， P＜0.01。表4同。

组别空白对照组LPS组水煎液组TFNG低剂量组中剂量组高剂量组剂量（ g／mL）－0.5 100 20 40 80 IL－8（ng／L）2.27±0.38 236.84±1.05 74.50±17.40 131.82±31.51 56.78±13.04 42.13±9.43 IL－6（ng／L）2.42±0.77 3 597.95±140.56 2 434.76±109.30 3 244.03±156.13 1 851.73±124.85 1 107.95±109.21 NO（ mol／L）1.32±0.31 11.40±0.91 8.71±0.65 10.21±0.86 8.91±0.30 7.84±0.43

表3 TFNG对豚鼠离体气管平滑肌的影响（±s，n＝8）

表3 TFNG对豚鼠离体气管平滑肌的影响（±s，n＝8）

注：与生理盐水组比较， P＜0.01。下表同。

组别生理盐水组阳性对照组水煎液对照组TFNG低剂量组中剂量组高剂量组终质量浓度（g／L）－0.008 10 124给药前2.65±0.11 2.49±0.37 2.56±0.25 2.58±032 2.66±0.31 2.71±0.21张力（g）给药后2.56±1.05 1.02±0.32 2.21±4.01 1.73±3.98 1.68±4.67 1.58±3.96 ACh解痉率（%）3.23±1.63 59.24±0.26 14.01±3.94 33.11±4.24 36.98±4.27 41.55±4.01

表4 TFNG对豚鼠离体气管平滑肌的影响（±s，n＝8）

表4 TFNG对豚鼠离体气管平滑肌的影响（±s，n＝8）

张力（g）组别生理盐水组阳性对照组水煎液组TFNG低剂量组中剂量组高剂量组终质量浓度（g／L）－0.008 10 124给药前2.43±0.23 2.53±0.27 2.72±0.47 2.61±0.14 2.65±0.32 2.57±0.12给药后2.33±2.08 0.55±2.14 1.64±9.86 1.61±8.99 1.51±10.60 1.28±6.12 His解痉率(%) 4.46±2.07 79.14±1.90 40.16±12.20 38.71±12.73 41.32±11.47 50.96±7.71

3 讨论

LPS是革兰阴性菌释放的一种内毒素，是炎性反应的诱导因素之一。当机体发生炎性反应时，LPS可进入肺内与相应的单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞表面受体蛋白发生特异性结合，促进炎性细胞释放IL－8，IL－6，NO等多种炎症因子，其过度表达激活了效应细胞产生趋化因子和炎症介质，加大炎性反应。

活化的巨噬细胞是炎性反应中的NO，IL－8，IL－6等细胞因子的重要来源[7－9]。NO作为炎症介质的重要因子之一，致炎物质可诱导或增加NO的合成和释放，从而促进炎症部位渗出和水肿。IL－8又称嗜中性粒细胞因子，对特异性和非特异性的免疫细胞具有强烈的趋化作用，其在炎症局部、血清和体液中均有显著增加。IL－6是一种多功能细胞因子，具有抗炎和致炎的双向功能，其作用与组织中的含量有关，正常水平的IL－6对机体有利，产生过多会引起一系列炎性损伤。

豚鼠气管平滑肌主要分布着M受体、β2受体和H1受体，其中M受体和H1受体兴奋使气管平滑肌收缩，β2受体兴奋使气管平滑肌舒张[10－11]。因此，ACh通过启动M受体，组胺作用于H1受体，发挥气管平滑肌收缩作用，总黄酮能抑制ACh、组胺引起的气管平滑肌收缩，表明其作用可能与抑制气管平滑肌M受体、H1受体有关。

本研究中，LPS刺激RAW264.7细胞后，可迅速诱导 IL－8，IL－6，NO的表达，TFNG高、中、低剂量组对IL－8，IL－6，NO的过量分泌具有不同程度的抑制作用，且呈一定的剂量依赖关系。豚鼠离体支气管解痉实验中，TFNG低、中、高剂量均可明显舒张豚鼠气管平滑肌，差异有统计学意义（P＜0.01）。

本研究结果显示，TFNG具有明显拮抗ACh和His收缩支气管平滑肌的作用，使支气管平滑肌松弛，支气管扩张，解除气管平滑肌痉挛，提示TFNG舒张支气管平滑肌作用可能与抑制气管平滑肌M受体、H1受体有关[12－13]。TFNG还可以一种剂量依赖性的方式下调细胞释放NO，IL－8，IL－6，从而介导炎性反应，缓解炎症部位炎性细胞浸润，提示TFNG可能通过抑制炎症因子IL－8，IL－6和NO的生成发挥抗炎作用。提示从瘤果黑种草子中提取的总黄酮的药理活性比水煎液强。

前期大量的动物药理试验表明，TFNG具有良好的体内抗炎及平喘作用[14－20]，本试验中主要针对 TFNG体外抗炎及豚鼠离体气管平滑肌解痉作用进行了研究。TFNG可能通过抑制气管平滑肌M受体、H1受体发挥气管解痉作用达到平喘的目的；通过下调巨噬细胞释放NO和IL－8，IL－6等炎症细胞因子发挥抗炎作用，达到减轻组织炎性细胞浸润及气道炎性反应的目的。其作用机制可能是瘤果黑种草子治疗呼吸系统疾病的物质基础。

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Effect of Total Flavones from Nigella Glandulifera on RAW264.7 Cells and Guinea Pig Tracheal Smooth M uscle

Cao Yuan1,Geng Dongsheng2,Sun Yuhua3,Yuan Fengjuan1
(1.Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China 830000; 2.Institute for Drug and Instrument Control,Joint Military Department,Xinjiang Military Area Command,Wulumuqi,Xinjiang,China 830063; 3.Institute of Materia Medica,Wulumuqi,Xinjiang,China 830004)

Objective To study the effect of total flavones from Nigella Glandulifera(TFNG)on RAW264.7 cells and guinea pig tracheal smooth muscle.M ethods The high,medium and low dose(20,40,80 μg／mL)of TFNG was used to detect the secretion of interleukin－8 in RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide(LPS)by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)and Griess Reagent method.IL－8,IL－6 and nitric oxide(NO)were measured.The tracheal spiral specimens of guinea pigs were prepared by the method of constant－temperature perfusion with tracheal trachea.The changes of the tension were observed by 1,2,4 g／L dose of TFNG and 10 g／L decoction on antipruritic effects of guinea pig tracheal smooth muscle induced by tacrolipotentin(ACh)and histamine(His).Results TFNG had no significant toxic effect on RAW264.7 cells at less than 100 μg／mL.Compared with LPS group,the TFNG low, medium and high dose group(20,40,80 μg／mL)could inhibit RAW264.7 cells and the levels of IL－6,IL－8 and NO(P＜0.05), and there was a significant dose－dependent relationship.The TENG low,medium and high dose group(1,2,4 g／L)could significantly relax the bronchial smooth muscle spasms of guinea pig induced by ACh and His,the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion TFNG has some anti－inflammatory and bronchial antispasmodic effects in vitro.

total flavones from Nigella Glandulifera;macrophage;bronchodilation;anti－inflammatory;guinea pig

R285.5

A

1006－4931(2017)05－0006－04

2016－12－07；

2017－01－07)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.002

国家自然科学基金[69483382]。

曹园（1991－），女，在读硕士研究生，研究方向为抗炎免疫，（电子信箱）1595645286＠qq.com。通讯作者：耿东升，硕士研究生，主任药师，研究方向为抗炎免疫，（电子信箱）dongsheng811＠sina.com。