越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠的抗抑郁作用研究

唐娟娟 王启盛 高 瞾 孙梦秋 张 垚 朱 婷 陈 刚

·实验研究·

越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠的抗抑郁作用研究

唐娟娟 王启盛 高 瞾 孙梦秋 张 垚 朱 婷 陈 刚

目的研究越鞠丸对帕金森病抑郁(PDD)模型小鼠的抗抑郁治疗效果及其作用机制。

帕金森病抑郁；越鞠丸；突触可塑性

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年常见的慢性神经退行性疾病, 临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势异常等运动症状, 此外还伴有嗅觉障碍、便秘、抑郁和焦虑等非运动症状。其中, 抑郁是PD最常见的非运动症状, 影响PD患者的生活质量, 损害患者认知功能及增加经济负担, 是影响PD患者治疗的重要因素［1］, 大量临床研究表明帕金森病伴发抑郁(Parkinson’s disease depression, PDD)的发病率超过50%［2］。目前临床实验认为选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂和行为干预对PDD有一定疗效［3］,但其疗效并未得到可靠的评价。越鞠丸始载于元代朱丹溪的《丹溪心法》, 方由苍术、香附、川芎、神曲、栀子五味药组成。中医理论认为越鞠丸专为郁病而设, 重在理气解郁, 兼顾六郁(汪昂《医方集解》)。大量研究证实以越鞠丸为基础方进行的抗抑郁治疗效果理想, 例如, 越鞠丸治疗中风后抑郁有效率为85.19%［4］；越鞠升降汤治疗老年抑郁症的长期效果与西酞普兰相当［5］。越鞠丸与度洛西汀联用, 疗效明显高于单用度洛西汀, 副作用少［6］。本研究制备MPTP亚急性小鼠模型, 从中筛选出PDD小鼠, 考察越鞠丸对帕金森病抑郁的治疗作用及相关机制。

1 材料来源

1.1 药物制备 越鞠丸的制备：香附、川芎、栀子、苍术、神曲(由南京国医堂门诊部药房购入), 每味药200 g打粉,过100目筛混匀, 室温浸于10倍量 95%乙醇中24 h, 收集浸出液, 重复2次。浸出液过滤后, 以55℃条件下减压浓缩,收集浓缩后浸膏48.4 g。MPTP购于Sigma公司。

1.2 动物来源 清洁级健康成年雄性Balb/c小鼠32只,体质量18～24 g, 军事医学科学院提供, 动物合格证号：2007000581303。适应性饲养1周后用于实验。动物房室温25℃, 湿度45%, 明暗交替时间为12 h, 动物可自由饮食进水。

1.3 仪器 强迫游泳视频分析系统(上海吉量软件公司),旋转蒸发仪(河南巩义予华仪器设备有限公司)。

2 方法及结果

2.1 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.2 帕金森病抑郁小鼠模型的建立 MPTP模型是经典的小鼠PD模型。MPTP模型诱导小鼠DA神经元丢失, 运动障碍的同时, 可诱导66.7% C57/b6小鼠出现抑郁样行为, 表现为悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间显著延长, 糖水偏好减少［7］。本实验中, 腹腔注射MPTP (30 mg/kg×5 d) 制备帕金森病亚急性模型, 等量生理盐水腹腔注射作为对照, 每组10只, 末次给药后7 d观察小鼠神经行为学指标, 从中筛选出PDD小鼠进行后续实验。

2.3 越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠自主活动的影响 开场实验(OPT)是用于评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。将动物放入箱内(40 cm×40 cm ×35 cm)底面中心, 同时进行摄像和计时。记录在5 min内的总活动路程和在中央区域的活动时间, 行为分析采用ANY-maze软件。爬杆实验(The pole test)是评价帕金森病模型小鼠运动功能常用方法之一, 在长50 cm、直径1 cm的垂直木杆顶端放一木塞, 将小鼠放在木塞上, 记录小鼠开始自动向下爬行的时间以及爬杆总时间。结果显示：开场实验中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg单次给药后, 小鼠活动总路程以及在中央区停留的时间比较差异均无统计学意义(P＞0.05);而爬杆实验中, MPTP造模后, 小鼠开始向下爬行时间以及爬杆总时间均延长(P＜0.05或0.01), 越鞠丸单次给药对其无显著影响(P＞0.05)。见图1。结果表明：越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠自主活动及运动功能无显著影响。

图1 越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠开场实验和爬杆实验中活动的影响

2.4 越鞠丸改善帕金森病抑郁模型小鼠抑郁样行为 悬尾实验(TST)用于反映动物的行为绝望。在距尾尖1 cm的部位用胶带将小鼠倒挂于横置的铁杆(直径约1 cm)上, 小鼠头部距离地面高度约30 cm。强迫游泳实验(FST)用于反映动物的行为绝望。实验前小鼠训练游泳15 min, 24 h后测试。

将小鼠放入水深15 cm的玻璃缸内, 水温25℃。两者均应用DepressionScan记录6 min内小鼠的运动状态, 测量后4 min内小鼠躯体及四肢不动的时间。糖水偏爱实验(SPT)用于反映抑郁症动物快感缺失症状。将分别装有蒸馏水和1%蔗糖水溶液的水瓶放于鼠笼上。记录10 h内小鼠摄入蒸馏水及糖水的量, 计算糖水偏爱率(糖水摄入量与总摄水量的比值)。结果显示：与对照组相比, MPTP模型组小鼠强迫游泳不动时间无明显变化(P＞0.05), 悬尾实验不动时间显著延长(P＜0.05), 糖水偏爱降低(P＜0.05)；越鞠丸单次给药后, 对小鼠强迫游泳不动时间无影响(P＞0.05), 显著降低悬尾不动时间(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水摄入量(P＜0.05)。见图2。

结果表明：越鞠丸能够改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁样行为。

图2 越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠强迫游泳、悬尾不动时间和糖水偏爱的影响

2.5 越鞠丸增加帕金森病抑郁模型小鼠前额皮层突触可塑性蛋白的表达 PSD-95是谷氨酸能神经元突触后致密蛋白家族中的一种膜相关蛋白, 在突触可塑性信号转导中发挥重要作用。Synapsin-1是调节突触结构和功能的关键前膜囊泡蛋白。GluR-1是AMPA受体的一种亚型, 而突触后膜上AMPA受体数量的变化可能是突触可塑性的机制之一。在抑郁症等诸多神经精神疾病中, 突触相关PSD-95, Synapsin-1和GluR-1等均会出现表达异常。结果显示：与对照组相比, MPTP模型组小鼠前额皮层PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表达显著下调(P＜0.01或0.05), 越鞠丸单次给药后, 这些突触可塑性相关蛋白表达显著增加(P＜0.05), 而越鞠丸对小鼠前额皮层PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基础表达水平无显著影响(P＞0.05)。见图3。结果表明：越鞠丸能够增强帕金森病抑郁模型小鼠前额皮层的突触可塑性。

图3 越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠前额皮层突触蛋白表达的影响

3 讨论

临床研究表明PDD患者部分继发于运动障碍或者药物治疗, 也有部分患者抑郁症状先于运动症状出现, 并且PDD的病理过程与运动症状的病理进程并不平行, 患者抑郁的严重程度与黑质多巴胺能神经元变性, 皮层纹状体环路功能障碍相关。说明 PDD 的发生有其神经生化及病理基础［8］。本实验室前期研究表明, 处于抑郁状态时, mPFC区萎缩, 神经元树突棘减少, 突触可塑性降低［9］。抗抑郁药能够通过增加mPFC脑源性神经营养因子(BDNF)释放, 激活蛋白激酶B和胞外信号调节激酶通路, 进而激活下游mTOR信号通路, 促进突触发生, 增强突触可塑性功能, 发挥抗抑郁作用［10］。

本研究中, 首次发现：①越鞠丸对帕金森病抑郁模型(经典MPTP亚急性模型)小鼠自主活动和运动功能无明显改善作用；②越鞠丸显著改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁样行为；③越鞠丸显著上调帕金森病抑郁模型小鼠前额皮层突触可塑性相关蛋白的表达水平。因此推测越鞠丸治疗帕金森病抑郁的作用机制可能是通过增加前额皮层突触可塑性蛋白的含量。并且, 作者前期研究发现越鞠丸通过下调NMDA受体NR1以及增强Akt/mTOR信号通路改善CUMS(慢性不可预知应激模型)小鼠的抑郁样行为, 发挥抗抑郁的作用。

帕金森病抑郁近年来愈发引起临床关注, 越鞠丸功用行气解郁, 临床常用于郁证的治疗。本研究在前期研究基础上,深化了对PDD病理机制的认识, 可能与前额皮层突触可塑性降低相关, 并进一步拓宽了越鞠丸的应用范围, 为临床应用越鞠丸治疗帕金森病抑郁提供了有力证据。

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Research of anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression model

TANG Juan-juan, WANG Qi-sheng, GAO Zhao, et al.Department of Physiology, School of Medicine and Life Sciences of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo research anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression (PDD) model, and its mechanism of action.MethodsA total of 32 clean and healthy male adult Balb/ c mice were randomly divided into control group and MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) subacute model group.Mice with depression manifestation in the model group were given single lavage by 11 g/ kg of Yueju pills.Anti-depression effect by Yueju pills for PDD mice was observed by forced swimming test, tail suspension test and sugar water preference test.Influence by Yueju pills on prefrontal cortex synaptic protein PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 levels in PDD mice was researched.ResultsAfter MPTP modeling and single administration by 11 g/kg of Yueju pills in open field test, there was no statistically significant difference of total distance in activity and duration of stay at central area (P＞0.05).After MPTP modeling in pole-climbing test, climbing down time and total pole-climbing time were all prolonged (P＜0.05 or 0.01), while single administration of Yueju pills showed no influence (P＞0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had no obvious change in immobility time during forced swimming test (P＞0.05), obviously prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05) and lowered sugar water preference (P＜0.05).Single administration of Yueju pills showed no influence on immobility time during forced swimming test (P＞0.05), but it remarkably prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05), and increased sugar water intake volume (P＜0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had obviously lowered prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＜0.01 or 0.05).Single administration of Yueju pills led to obviously increased synaptic plasticity-related protein (P＜0.05), while it had no remarkable influence on prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＞0.05).ConclusionYueju pills shows excellent anti-depression effect for micein Parkinson’s disease depression model.Its mechanism may have correlation with increased synaptic plasticityrelated protein as prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression in PDD mice.

Parkinson’s disease depression; Yueju pills; Synaptic plasticity

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.07.099

2017-02-24］

江苏省自然科学青年基金(项目编号：BK20161044)；国家自然科学青年基金(项目编号：81603089)

210023 南京中医药大学医学与生命科学院生理学系

唐娟娟

方法清洁级健康成年雄性Balb/c小鼠32只, 随机分为对照组和MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶)亚急性模型组, 模型组中筛选出抑郁样表型小鼠, 单次灌胃给予越鞠丸11 g/kg, 通过强迫游泳, 悬尾以及糖水偏爱实验观察越鞠丸对PDD小鼠的抗抑郁治疗作用, 并考察越鞠丸对PDD小鼠前额皮层突触蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1水平的影响。结果开场实验中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg单次给药后, 小鼠活动总路程以及在中央区停留的时间比较差异均无统计学意义(P＞0.05);而爬杆实验中, MPTP造模后, 小鼠开始向下爬行时间以及爬杆总时间均延长(P＜0.05或0.01), 越鞠丸单次给药对其无显著影响(P＞0.05)。与对照组相比, MPTP模型组小鼠强迫游泳不动时间无明显变化(P＞0.05),悬尾实验不动时间显著延长(P＜0.05), 糖水偏爱降低(P＜0.05)；越鞠丸单次给药后, 对小鼠强迫游泳不动时间无影响(P＞0.05), 显著降低悬尾不动时间(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水摄入量(P＜0.05)。与对照组相比, MPTP模型组小鼠前额皮层PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表达显著下调(P＜0.01或0.05), 越鞠丸单次给药后, 这些突触可塑性相关蛋白表达显著增加(P＜0.05), 而越鞠丸对小鼠前额皮层PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基础表达水平无显著影响(P＞0.05)。结论越鞠丸对帕金森病抑郁模型小鼠具有显著抗抑郁样作用, 其机制可能与越鞠丸增加PDD小鼠前额皮层突触可塑性相关蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1的表达有关。