Thl7细胞在急性髓系白血病中表达失衡的研究

张雪华，贾燕

济宁市第一人民医院，山东济宁272011

Thl7细胞在急性髓系白血病中表达失衡的研究

张雪华，贾燕

济宁市第一人民医院，山东济宁272011

研究Thl7细胞在急性髓系白血病(AML)患者骨髓与外周血中的表达水平，进一部探讨急性髓系白血病的发病机制。并探讨Thl7细胞比例的改变与病人临床的相关性。方法①用实时荧光定量（RT-PCR)分别检测AML初诊组、化疗完全缓解及正常对照组骨髓及外周血单个核细胞中Th17转录因子（RORC)的表达水平。②用流式细胞术分别检测AML初诊组、化疗完全缓解及正常对照组外周血中Thl7细胞所占比例。结果AML初诊组外周血中Th17细胞表达水平（0.98±0.058）明显低于完全缓解组（2.08±0.76）及正常对照组（1.79±0.306），差异有统计学意义（P＜0.05)。AML初诊组(中位数0.000 036 418 3范围0.000 003 328 5～0.001 410 087 1）外周血单个核细胞（PBMCs)RORC mRNA的表达水平明显低于完全缓解组（中位数0.000 187 543 4范围0.000 025 426 0～0.001 221 892 7）及正常对照组（中位数0.002 644 026范围0.000 063 627 0～0.000 956 465 1），差异有统计学意义(P＜0.001)。初诊组（中位数0.000 036 798 3范围0.000 005 010 3～0.000 512 556 9）骨髓单个核（BMMCs)RORC，显著低于完全缓解组（中位数0.000 102 885 9范围0.000 014 073 4～0.001 568 208 7），差异有统计学意义（P＜0.001)。初诊的AML患者接受治疗达到完全缓解后外周血RORC mRNA的表达恢复到正常水平，差异有统计学意义。结论Thl7细胞表达失衡可能与AML的发生发展相关。

急性髓系白血病，Th17细胞；RORC；mRNA

急性髓系白血病(AML)是一种血液系统的恶性肿瘤，主要发生于成年人。近年来治疗方法虽然有所改进对于大多数类型的AML患者预后依旧不良。部分患者经化疗难以获得缓解，或者获得缓解后复发。近年来，大量研究关于免疫系统在血液系统恶性肿瘤的发生发展中的作用表明Th亚群失衡有利于恶性血液系统疾病的发展。Th17细胞与Treg都来源于初始T细胞是新发现的CD4+细胞，在机体免疫防御中发挥重要作用。Th17细胞与Treg细胞介导的免疫耐受功能相互拮抗，在维持机体的免疫稳定中发挥重要的作用。之前的研究发现Treg细胞在AML患者的骨髓中表达失衡。而且多项研究表明肿瘤的微环境中Treg细胞的数量明显增多。研究Th17细胞在急性髓系白血病中的变化，有利于对急性髓系白血病发病机制的研究，为急性髓系白血病（AML)免疫治疗提供了新的方法。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集90例初诊AML患者（42例女性，48例男性）78例完全缓解的AML患者（31例女性及48例男性）28名正常对照（13名女性，15名男性）外周血和部分初诊者和完全缓解者的骨髓，并搜集相应的临床资料。

1.2 流式细胞术对胞内细胞因子进行研究

使用肝素抗凝的外周血全血与同等体积的RPMI 1 640培养基（400 μL）在终浓度50 ng/mLPMA（phorbol myristate acetate）、1 μM离子霉素和500 ng/mL莫能霉素（monensin）刺激下，在37℃、5%CO2孵育4 h。PMA和离子霉素的药理作用是T细胞活化剂，是一种TCR复合物产生的模拟信号，并有激活任何特异性T细胞抗原的优势。莫能霉素是用来阻止细胞内运输机制，从而导致细胞因子在细胞积累。孵育后，用PE-Cy5标记的CD3和抗CD8单克隆抗体染色,在室温下,避光持续20 min；表面染色后,细胞固定破膜，然后根据说明书用FITC标记的anti-IFN,PE标记的anti-IL-17。同时给出了同型对照，以确认抗体特异性。最后使用Beckman gallios cytometer(Beckman Coulter,USA)流式细胞仪对染色细胞进行了分析，并配备Summit软件光盘。分析Th亚群时首先在淋巴细胞中画出CD3+CD8-的细胞。然后在CD3+CD8-的门中分析Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞。

1.3 实时定量PCR检测Th17细胞相关的转录因子RORC mRNA的表达量

使用Ficoll密度梯度离心法分离AML患者EDTA抗凝的外周血与骨髓PBMCs和BMMCs。利用常规Trizol方法进行细胞总RNA提取。具体造作步骤如下：①收集1×106细胞分入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol充分混匀，保存于-20～-80℃的冰箱中，以防止RNA降解。(放入-80℃储存的标本，向其中加入1 mL Trizol，用移液枪反复吹吸至无明显沉淀，移入一新EP管中，室温静置5 min。②加入氯仿（Trizol的1/5体积量，200 uL），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿易挥发，震荡时应小心离心管盖突然弹开），待充分成成乳糜状，室温静置5 min。③12 000 rpm 4℃离心15 min（从离心机中小心取出Ep管，此时匀浆液分为三层，即无色的上清液，中间的白色蛋白层，下层为有机相），吸取上清液，移至一新的Ep管中。（切忌吸出中间层）④加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10 min。⑤12 000 rpm 4℃离心15 min，一般在离心后试管底部会出现白色沉淀，用移液器吸弃上清。⑥缓慢沿离心管壁加入75%乙醇500 uL（切勿触及沉淀）,轻轻上下颠倒，12 000 rpm 4℃离心5 min，小心弃去乙醇，室温放置15 min，使乙醇挥发。⑦各管中分别加入适量的DEPC-ddH2O混匀溶解，-80℃保存，尽快反转。⑧仪器测定RNA浓度和纯度。把RNA反转录成cDNA反转录体系如表1。

表1 反转体系(20 uL)

短暂离心混匀后，37℃反应15 min，85℃5 s，短暂离心使管壁的水份沉于管底。实时荧光定量检测反应体系如表2。

表2 反应体系(10 uL)

2 结果

2.1 Th17细胞转录因子RORC mRNA在骨髓及外周血单个核细胞中的表达

AML初诊患者骨髓单个核细胞(BMMCs)中RORC表达（中位数0.000 036 8范围0.000 005 01～0.000 513）较缓解组（中位数0.000 103范围0.000 014 1～0.001 57），显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001)[图1]。AML初诊组(中位数0.000 036 4范围0.000 003 33～0.001 41）外周血单个核细胞（PBMCs)RORC mRNA的表达水平明显低于完全缓解组（中位数0.000 188范围0.000 025 4～0.001 22）及正常对照组（中位数0.00264范围0.000 063 6～0.000 956），差异有统计学意义(P＜0.001) [图2]。

2.2 Th17亚群细胞在AML患者外周血中失衡

图1

图2

图3

图4

实验结果表明Th17细胞在AML的外周血中失衡。Th17在适应性免疫中起重要的作用，在实验中发现Th17细胞在初诊组中(0.987±0.058)相对于缓解组(2.08± 0.76)和正常对照组（1.79±0.31)明显降低有统计学意义(P＜0.05)[图3]。

2.3 化疗使初诊患者的Th17细胞转录因子RORC回复到正常水平

为进一步了解Th17细胞在急性髓系白血病中的作用，追踪随访28例急性髓系白血病(AML)患者从初诊到经过化疗达到完全缓解。该研究发现AML患者外周血单个核细胞RORC的表达水平经过化疗后恢复到正常水平[图4]。

4 讨论

急性髓系白血病是一种起源于骨髓造血干细胞的恶性血液系统肿瘤，主要发生于成年人，严重威胁人类的生存健康。近年来随着医学技术的提高和新药的开发，急性髓系白血病(AML)的治疗有了很大的提高，但是对于大多数类型的AML预后依旧不良。大量的研究表明免疫系统的失衡能够促进急性髓系白血病的发生发展。Frida Ewald Sander的研究表明Th细胞的失衡可引起急性髓系白血病细胞的免疫逃逸，与急性髓系白血病的复发有关[1],最进研究[2]表明在急性髓系白血病中Treg细胞和与它相关的细胞因子IL-10及其重要的转录因子FOXP3在初诊的白血病患者骨髓中比通过治疗完全缓解后的病人骨髓中明显增高。Th17细胞作为免疫调节的重要因子在免疫性疾病和炎性疾病中起着重要的作用。已有研究表明Th17细胞与恶性肿瘤的发生发展有关,但仍存在着争议。在一些恶性肿瘤疾病Th17细胞与患者的生存预后成正相关，而在一些类型的癌症中Th17与患者的生存预后成负相关[3]。Th17细胞在抗肿瘤的免疫反应中发挥重要的作用，通过释放炎性因子介导细胞免疫杀伤肿瘤细胞，然而Amicarella F等人认为Th17在结肠癌中起双刃剑的作用，既有促进疾病发展的作用也有阻碍疾病发展的作用[4-5]。

Th17细胞与Treg细胞都起源于初始的CD4+细胞，它们之间相互拮抗对维护机体免疫系统的稳定起着重要的作用[6]。Th17/Treg的比例失调能够促进一些疾病的发生例如类风湿性关节炎，SLE等[7-9]。Treg细胞抑制免疫反应，使机体产生免疫耐受，促使肿瘤细胞免疫逃逸。Th17主要通过IL-17等细胞因子动员、募集和活化中性粒细胞，介导促炎性反应。在之前的研究已证明Treg细胞在初诊急性髓系白血病病人骨髓与外周血中都有明显的升高[10]。在血液系统其他肿瘤中已发现Th17/Tregs失衡的现象，例如李晶晶等人在骨髓瘤中发现Th17/ Treg失衡的现象[11]。在肿瘤发生发展中Th17介导的免疫反应可以被升高的Treg细胞抑制，从而促进了肿瘤的发展[12]。

该研究表明Th17的转录因子RORC在初诊急性髓系白血患者的外周血单个核和骨髓单个核细胞中明显的比治疗缓解的患者和正常人明显的降低，甚至不表达。Th17细胞在初诊组外周血比治疗缓解后患者外周血和正常人外周血也明显的降低。结合之前关于Treg细胞的研究可以推断Th17/Treg细胞存在着失衡。Th17/ Treg的失衡可能对急性髓系细胞白血病的发生发展起其重要的作用。Th17的减少降低了对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，而增加的Treg细胞促进肿瘤细胞的免疫逃逸。研究急性髓系细胞白血病中Th17的失衡有利于对急性髓系白血病发病机制进一步阐述，可为急性髓系白血病的免疫治疗提供有力的参考依据。

[1]Frida Ewald Sander,Anna Rydstrm,Elin Bernson,et al. Dynamics of cytotoxic T cell subsets during immunotherapy predicts outcome in acute myeloid leukemia[J].Oncotarget, 2016,7(7):7586-7596

[2]Tian T,Yu S,Liu L,et al.The Profile of T Helper Subsets in Bone Marrow Microenvironment Is Distinct for Different Stages of Acute Myeloid Leukemia Patients and Chemotherapy Partly Ameliorates[J].These VariationsPLoS One,2015, 10(7):e0131761.

[3]Ivanova EA,Orekhov AN，Berhard Bonnotte2.T Helper Lymphocyte Subsets and Plasticity in Autoimmunity and Cancer:An Overview[J].Biomed Res Int，2015:327-470.

[4]Amicarella F1,Muraro MG1,Hirt C1,et al.Zlobec I10,Terracciano L11,Tornillo L11，Zajac P1，Eppenberger-Castori S11, Trapani F11,Oertli D5，Iezzi G1Dual role of tumour-infiltrating T helper 17 cells in human colorectal cancer[J].BMJ, 2015 Dec 30.pii:gutjnl-2015-310016.

[5]Vesely M.D,Kershaw MH,Schreiber RD,et al.Natural innate and adaptive immunity to cancer[J].Annual Review of Immunology,2011（29）:235-271.

[6]R Arsenescu，V Arsenescu，J Zhong，et al.Role of the xenobiotic receptor in inflammatory bowel disease[J].Inflammatory Bowel Diseases,2011,17(5):1149-1162.

[7]Arsenescu R.Role of the xenobiotic receptor in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis，2011，17(5):1149-1162.

[8]Kobayashi S,et al.A role for the aryl hydrocarbon receptor and the dioxin TCDD in rheumatoid arthritis[J].Rheumatology (Oxford),2008，47(9):1317-1322.

[9]YangJ.Recovery of the immune balance between Th17 and regulatoryTcellsasatreatmentforsystemiclupus erythematosus[J].Rheumatology(Oxford),2011，50(8):1366-1372.

[10]W Yang，Y Xu.Clinical significance of Treg cell frequency in acutemyeloidleukemia[J].International Journal of Hematology, 2013,98(5):558-562.

[11]李晶晶，牛倩，唐笛娇，等.前多发性骨髓瘤患者外周血Thl和Treg细胞比率的平衡关系研究[J].中华血液血杂志，2013，34（1）：936-940.

[12]Steer HJ,Lake RA,Nowak AK,et al.Harnessing the immune response to treat cancer[J].Oncogene，2010，29(48):6301-6313.

Research on Thl7 Cell in the Imbalance Expression in the Acute Myeloid Leukemia

ZHANG Xue-hua,JIA Yan
Jining First People’s Hospital,Jining,Shandong Province,272011 China

ObjectiveTo research the expression level of Thl7 cell in bone marrow and peripheral blood of AML patients and further study the pathogenesis pf acute myeloid leukemia and correlation between Thl7 cell ratio change and patients clinical manifestations.MethodsThe expression level of RORC in bone marrow and peripheral blood in the AML first-visit group,chemotherapy complete remission group and normal control group were tested by the RT-PCR.The Thl7 cell ratio in peripheral blood in the AML first-visit group,chemotherapy complete remission group and normal control group was tested by the flow cytometry.ResultsThe Th17 cell expression level in the peripheral blood in the AML first-visit group was obviously lower than that in the chemotherapy complete remission group and normal control group,[（0.98±0.058）vs（2.08± 0.76）,（1.79±0.306）],and the difference had statistical significance（P＜0.05),the（PBMCs)RORC mRNA expression level in the AML first-visit group(median:0.000 036 418 3,range;0.000 003 328 5～0.001 410 087 1),was obviously lower than that in the complete remission group,(median:0.000 187 543 4,range:0.000 025 426 0～0.001 221 892 7)and in the normal control group,(medians:0.002 644 026,range:0.000 063 627 0～0.000 956 465 1),and the difference had statistical significance,P＜0.001,and the（BMMCs)RORC in the first-visit group(medians:0.000 036 798 3,range:0.000 005 010 3～0.000 512 556 9)was obviously lower that in the complete remission group,(medians:0.000 102 885 9,range:0.000 014 073 4～0.001 568 208 7),and the difference had statistical significance（P＜0.001）,and the RORC mRNA expression returned to the normal level after treatment in the AML first-visit group with statistical significance.ConclusionThe imbalance expression of Thl7 cells may be related to the occurrence and development of AML.

Acute myeloid leukemia;Th17 cell;RORC;mRNA

R733.71

A

1672-5654（2017）03（b）-0041-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.08.041

2016-12-12）

张雪华（1987-），女，山东济宁人，硕士，住院医师，研究方向：血液肾脏。