外用8-甲氧补骨脂素诱导的黄褐斑动物模型研究

苏美丽，许亚莹，张理平

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

外用8-甲氧补骨脂素诱导的黄褐斑动物模型研究

苏美丽，许亚莹，张理平

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的采用综合造模法创建小鼠皮肤黄褐斑动物模型。方法30只KM雌性小鼠随机分为空白组、造模1组、造模2组。除空白组外，造模1组和造模2组根据文献均每日用波长320 nm的中波紫外线（UVB）照射小鼠背部皮肤1次，照射时间30 s，并每日定时肌肉注射1%黄体酮注射液2 mL／kg体重，两腿交替注射；同时每日将小鼠置于特制的束缚桶内束缚30 min；造模2组同时局部外涂8-甲氧补骨脂素（8-MOP），每日1次。造模4周后，HE染色和免疫组化染色观察皮肤黑色素细胞病理形态学。结果①HE染色结果：造模1组和造模2组小鼠皮肤黑色素细胞的上皮层增生数、真皮血管数和真皮炎性细胞数高于空白组（P＜0.01）；造模2组小鼠皮肤黑色素细胞的上皮层增生数、真皮血管数和真皮炎性细胞数高于造模1组（P＜0.01）。②免疫组化染色结果：造模1组和造模2组小鼠皮肤黑色素细胞的HIS、平均光密度和积分光密度高于空白组（P＜0.01）；造模2组小鼠皮肤黑色素细胞的HIS、平均光密度和积分光密度高于造模1组（P＜0.01）。结论采用小鼠皮肤局部黄体酮注射+慢性束缚＋局部紫外线照射＋外涂8-甲氧补骨脂素的综合实验方法建立的黄褐斑小鼠模型，更加接近人类黄褐斑病变特征。

黄褐斑；黄体酮；紫外线；慢性束缚；8-甲氧补骨脂素

黄褐斑（chloasma）是一种多因素产生的慢性皮肤色素代谢障碍性疾病，至今尚无疗效确切的治疗药物。本研究根据内分泌失调、日晒是黄褐斑产生的主要因素，皮损区黑色素细胞分泌黑色素颗粒增多是其主要病理变化的机制，采用小鼠皮肤局部黄体酮注射＋慢性束缚＋局部紫外线照射＋外涂8-甲氧补骨脂素（8-MOP）［1］的综合实验方法造模，为建立更加接近人类黄褐斑病变特征动物模型提供实验依据。

1实验材料

1.1实验动物清洁级KM雌性小鼠，体质量（20± 2）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：00513712。

1.2药物及试剂甲氧沙林溶液（重庆华邦制药有限公司）；黄体酮注射液（20 mg／支，浙江仙琚制药股份有限公司）；一抗bs-7362R（南京建成生物工程研究所）

1.3仪器UV236B中波紫外线照射仪（德国Waldman公司）；BX51T-PHD-J11显微镜（日本奥林巴司公司）；形态学显微图像分析系统（德国徕卡仪器有限公司）

2实验方法

2.1分组与造模小鼠购回饲养1周后，按随机数字表法分为空白组、造模1组、造模2组，每组各10只。具体造模方法如下：①空白组：用10%的NaS2水溶液背部脱毛，每2 d脱毛1次，背部裸露约2 cm×2.5 cm的皮肤；每日肌肉注射注射用生理盐水5 mL／kg体重。②造模1组：脱毛同空白组，每日用波长320 nm的中波紫外线（UVB）照射小鼠背部皮肤1次，照射时间30 s；并每日定时肌肉注射1%黄体酮注射液2 mL／kg体重，两腿交替注射；同时每日将小鼠置于特制的束缚桶内束缚30 min。③造模2组：方法同组②，同时局部外涂8-甲氧补骨脂素，每日1次。

2.2标本采集造模完4周后取各组小鼠背部脱毛部位皮肤一块（约0.5 cm×1 cm），剔除其皮下脂肪和黏液组织，用4℃的预冷生理盐水冲洗干净，拭干水分。用4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。

2.3指标观察

2.3.13组小鼠皮肤黑色素细胞的病理形态学观察切片经HE染色，每张切片选取5个不同视野，根据图象分析管理系统计数上皮层增生数、真皮血管数及真皮炎性细胞数；切片经免疫组化染色，每张切片选取5个不同视野，根据图象分析管理系统计算黑素细胞染色面积和程度。

2.3.2显微镜图像分析黑色素细胞用CMOS计算机图像处理系统和专用软件进行图象分析，每例观察5个不同视野。确定黑色素细胞后，用多功能真彩色细胞图象分析管理系统对目标图象进行定量分析：400倍视野下统计黑色素细胞百分比，观察其染色程度并进行免疫组化评分（immunohistochemical score，HIS）。评分方法如下［4］：A为阳性细胞百分率，A＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分；B为阳性细胞染色程度，B为阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。A、B两项乘积即为该例组织的HIS，并根据图象分析管理系统计算出平均光密度和积分光密度。

2.4统计学方法用SPSS 20.0统计软件进行统计处理。计量资料均符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3实验结果

3.13组小鼠皮肤黑色素细胞HE染色结果空白组鳞状上皮较薄，无增生，由排列整齐的基底细胞和棘细胞组成，共1～2层，表面有少量角质；真皮中见正常的毛囊、皮脂腺，未见汗腺、血管、炎性细胞；结缔组织、皮下脂肪及肌肉组织未见特殊。造模1组小鼠皮肤的上皮层较空白组增生明显，共约2～3层，角质层增厚，表皮细胞数增多，毛囊和皮脂腺增生明显，血管、炎性细胞增多。造模2组小鼠皮肤的上皮层较造模1组明显增生，共约4～6层，角质层增厚，表皮细胞数增多，毛囊和皮脂腺增生明显，血管、炎性细胞明显增多。见图1。

图13组小鼠皮肤HE染色图（×200）

3.23组小鼠皮肤黑色素细胞上皮层增生数、真皮血管数、真皮炎性细胞数比较见表1。3.33组小鼠皮肤黑色素细胞免疫组化结果空白组小鼠皮肤表皮中几乎未见黑色素细胞，基底层可见单个散在分布的黑色素细胞，胞浆着色呈棕黄色。造模1组小鼠皮肤表皮中可见少量黑素色细胞，基底层可见多个散在分布的黑色素细胞，着色面积较空白组大。造模2组皮肤表皮中可见大量黑色素细胞，表皮基底层可见多个成簇分布的黑色素细胞，着色面积较造模1组大，呈强阳性反应，胞浆着色呈深褐色。见图2。

表13组小鼠皮肤黑素细胞上皮层增生数、真皮血管数、真皮炎性细胞数比较（x±s）

图23组小鼠皮肤黑素细胞免疫组化图

3.43组小鼠皮肤黑色素细胞HIS、平均光密度、积分光密度比较见表2。

4讨论

8-甲氧补骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）主要存在于多种常见中草药如蛇床子、北沙参、白芷、枳实、羌活、芫荽等根茎或果实中，由于8-MOP结构简单，易与DNA发生相互作用，有较多的生物活性［5］。8-MOP对鼠类B16黑色素瘤细胞株具有较好的促进黑色素生成作用［6］，是治疗白癜风的药物。其外用的机理为：8-MOP是光敏性化合物，能增加黑色素细胞的密度，增加黑色素细胞中酪氨酸酶的活性，从而促进黑色素的生化合成、转运和扩散［7］。该作用机制与黄褐斑产生的机理颇为相似，为此，我们在目前文献报道的多因素黄褐斑小鼠动物模型研究的基础上（紫外线照射＋黄体酮注射＋慢性束缚法［2-3］），增加外用促进黑素细胞分泌黑素的药物（8-MOP）的方法进行小鼠黄褐斑动物模型的建立，以期创建更加符合人类黄褐斑产生的动物模型，为治疗黄褐斑新药研究奠定基础。

表23组小鼠皮肤黑素阳性目标HIS、平均光密度、积分光密度比较（x±s）

目前，判断黄褐斑动物模型成功与否的重要指标有皮肤黑色素细胞病理形态学观察以及生化指标检测。而前者是最直接、最客观的指标。光密度是反映物体颜色的深浅度，是反映物体对光的吸收率（透过率）的指标。颜色越深，对光线的吸收越多，光密度越高。积分光密度是平均光密度与面积的乘积，颜色越深，面积越大，积分光密度越高［8］。因此，平均光密度、积分光密度可作为观察黑素细胞着色深浅度的量化指标。

本实验中，我们在光镜下观察到造模2组小鼠皮肤黑色素细胞较造模1组明显增多。而计算机的病理图像学定量分析结果显示：造模2组同造模1组及空白组比较，小鼠皮肤黑色素的HIS、平均光密度、积分光密度均有显著性差异。因此，采用小鼠皮肤局部黄体酮注射+慢性束缚+局部紫外线照射+外涂8-MOP的综合实验方法建立的黄褐斑小鼠模型是成功的。但是没有对模型的稳定性和维持时间进行观察，如果模型不够稳定或维持时间过短，在药物治疗实验过程很难对药物的有效性做出评价。因此，模型稳定性或维持时间是评价模型是否成功的关键，这些不足有待进一步研究完善。

［1］张理平.治疗黄褐斑中药研究的思索［J］.中华医学美学美容杂志，2005，11（4）：248-249.

［2］汪南玥，陈家旭，吴晓丹.肝郁型黄褐斑小鼠模型的建立及其与现有模型的比较研究［J］.中华中医药杂志，2007，22（5）：161-163.

［3］薄纯光.黄褐斑肝气郁证小鼠模型的建立及消斑灵干预［D］.济南：山东中医药大学，2013：1-31.

［4］YING M A，LIN M A，QUAN GUO，et al.Expression of bone morphogenetic protein-2 and its receptors in epithelial ovarian cancer and their influence on the prognosis of ovarian cancer patients［J］.Joural of Experimental&Clinical Cancer Research，2010，29（1）：461-462.

［5］杨倩，杨俭.8-甲氧补骨脂素药理作用研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2014，19（10）：1177-1178.

［6］YE Y，CHOU G X，WANG H，et al.Flavonoids apigenin snd icariin exert poten melanogenic activities in murine B16 melanoma cells［J］.Phytomedicine，2010，18（1）：32-35.

［7］龚小梭.8甲氧补骨脂素和艾洛松联合外用治疗白癜风60例［J］.皮肤病与性病，2006，28（2）：42-43.

［8］汪薇，王诗航.光密度值测定在实验医学研究中的应用及意义［J］.解剖科学进展，2006，12（3）：286.

R285.5

A

1000-338X（2017）02-0053-03

2017-12-15

福建中医药大学大学生创新创业训练计划项目

（201610393080）

苏美丽（1991—），女，硕士研究生，主要从事中医美容方药的研究。

张理平（1958—），女，教授、硕士生导师。

E-mail：1223754614@qq.com