苹果渣乳酸菌发酵工艺条件优化

杨 辉， 闫晓哲， 杜娇娇

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



苹果渣乳酸菌发酵工艺条件优化

杨 辉， 闫晓哲， 杜娇娇

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

为了充分利用苹果渣，开发附加值高的苹果产品，提升苹果深加工水平，采用苹果渣与新鲜苹果复配浸提汁液，得到的浸提汁进行乳酸发酵.以总酸为主要指标对乳酸发酵菌种进行了选择；以乳酸菌浓度为指标通过单因素实验确立了碳源、氮源，并采用正交试验对发酵工艺参数进行了优化.结果表明：优百伦发酵剂为乳酸发酵适宜菌种，其适宜发酵条件为初始pH 6.5、接种量0.4%、蔗糖添加量3%、玉米浆添加量0.5%，在此条件下，所得乳酸醪液单位体积活菌数含量大于9.43×108CFU/mL，发酵液总酸含量大于7.74 g/L,有利于乳酸饮料的生产与开发.

苹果渣； 乳酸菌发酵； 发酵剂； 乳酸菌； 活菌数； 总酸

0 引言

中国是苹果种植大国,占世界的40%以上[1]，果汁生产中果渣产量达到苹果总量的20%～ 30%.据调查，这些果渣除15%～20%用作燃料，约10%做饲料外，70%被废弃.大量的废弃果渣不但严重污染环境，还造成苹果资源的浪费.如能对果渣资源进行开发利用，不仅可以减少废弃物的排放，而且能增加果品的附加值，增加果业的经济效益[2].

乳酸是乳酸菌发酵的主要产物，能抑制有害微生物的繁殖；能够促进胃肠蠕动；提高钙、磷、铁、维生素D的吸收利用率；可赋予发酵饮料纯朴的酸味和清爽的风味，增加产品的爽口性.近年来，随着果蔬业的发展，果蔬乳酸饮料的研究成为发酵饮料的研究热点之一.张云涛等[3]、李冰[4]、高晗[5]对红枣汁乳酸发酵饮料进行了研究；王立霞[6]对和田玉枣乳酸发酵关键技术进行了研究；郑瑞婷等[7]、王晓晴等[8]对猕猴桃汁乳酸发酵饮料加工工艺进行了研究；王健等[9]对莜麦乳酸发酵饮料制备工艺进行了研究.

苹果渣含有丰富的营养物质和活性物质，它们具有抗氧化性、降低胆固醇和减肥的作用，因而是生产乳酸饮料的适宜原料，本文对苹果渣乳酸发酵工艺进行了研究，乳酸发酵中培养基成分是影响发酵的重要因素，国内外对于乳酸菌发酵培养基的研究较多，李想等[10]以MRS培养基为对照对植物乳杆菌碳、氮和磷源进行了筛选和优化，结果得到酵母膏为植物乳杆菌的适宜氮源；李文友等[11]以玉米浆代替酵母粉、豆粕水解液、生物素为氮源，对L-乳酸发酵进行了研究，结果表明以玉米浆代替酵母粉等为有机氮源发酵L-乳酸是可行的，而且降低了乳酸的生产成本；高年发等[12]、于雷等[13]也对乳酸发酵培养基进行了优化，也得到了用玉米浆代替酵母粉是可行的；潘丽军等[14]以豆粕水解液为氮源，对细菌乳酸发酵基础培养基进行了优化，得到了相似的结论——玉米浆可用于乳酸发酵.

上述培养基优化中采用的菌种并非本研究所采用的菌种和原料，故本实验采用苹果渣为原料，通过添加不同的氮源和碳源对果渣培养基进行优化，企图寻找一种有利于乳酸菌发酵的苹果渣培养基，为利用果渣生产一款乳酸菌功能饮料打下基础，同时解决果渣所带来的环境问题，为果农增加经济效益.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

旬邑红富士苹果：市售、成熟度好、无虫害、无机械损伤；果渣：新鲜苹果榨取的果渣，氧化程度低；Vc，蔗糖(食品级)，果胶酶(食品级).

1.2 菌种

嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、酸奶发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌混合菌种)：优百伦生物科技有限公司.

1.3 培养基

MRS[15]肉汤培养基(一级培养基)： 蛋白胨10 g、酵母粉5 g、柠檬酸二铵2 g、葡萄糖20 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、牛肉膏10 g、K2HPO42 g、乙酸钠5 g、吐温-80 1 mL、MgSO4·4H2O 0.25 g、琼脂粉15～20 g,蒸馏水1 000 mL.

生产培养基：苹果果渣果浆浸提液.

1.4 设备与仪器

恒温培养箱(山东潍坊医疗器械厂),pH仪(成都市方舟科技开发公司),电子分析天平(赛多利斯(北京)科技有限公司),电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),超净工作台(苏州净化设备工作厂),榨汁机(广东美的精品电器制造有限公司),灭菌锅(江阴滨江医疗设备有限公司).

1.5 实验方法

1.5.1 乳酸发酵培养基优化

取新鲜果渣40 g和新鲜切块的苹果30 g混合打浆，加入0.1%VC溶液[16]护色，按料液比7∶3(W∶V)加入30 mL蒸馏水进行浸提，90 ℃～92 ℃灭菌20 min，待冷却后添加0.6 g/L的果胶酶，常温下酶解4 h，过滤得到澄清浸提液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和碳酸钠调整浸提液pH后,加入定量的蔗糖和玉米浆补充碳源、氮源，接入相应菌种，在40 ℃下发酵至总酸基本不变，结束发酵，并测定发酵液中活菌数、总酸含量.

1.5.2 菌种的选育

利用实验室已有菌种，在适宜的条件下将乳酸菌接入果渣浸提液中，发酵至总酸基本不变，测定发酵前后总糖、总酸含量的差值并计算转化率.选取总糖消耗高、产酸多、产率高的菌株或者发酵剂作为实验生产菌种.

1.5.3 单因素实验

将浸提液经过灭菌后接入乳酸菌进行发酵，以总酸、转化率为考量指标， 确定合适的发酵菌种，考察接种量、初始pH、蔗糖添加量、玉米浆添加量对发酵的影响.实验方案：乳酸菌接种量选为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；初始pH为5.5、6.0、6.5、6.7、7.0；在蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉中选择一种较佳的碳源，并设置添加梯度1%、2%、3%、4%、5%寻找较佳添加量；在蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸钠、尿素选择一种较佳氮源，并设置添加梯度0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%寻找较佳添加量；以发酵液中活菌数为主要指标，总酸含量为参考指标，确定各个因素的范围.

1.5.4 正交试验

依单因素实验结果，接种量(A)，碳源用量(B)，氮源用量(C)，选初始pH(D)为因素，每个因素选取3水平，按L9(43)设计正交试验方案(以发酵结束时活菌数为考察指标).

1.5.5 检测方法

总酸按国标GBT 12456-2008方法测定；总糖按国标GBT 15038-2006方法测定；发酵液中活菌数按国标GB 47893-2010方法测定.

2 结果与讨论

2.1 菌种选取

图1给出了不同菌种发酵产酸情况.本实验中采用的发酵剂有链球菌属和杆菌属的乳酸菌，其中嗜热链球菌分解蛋白质产生甲酸和丙酸促进了杆菌的生长，杆菌在发酵过程中释放的物质是链球菌基本的生长因素，使球菌生长较快，形成了共生现象.菌种之间协同发酵使菌种活力更加旺盛，产酸量大幅度提高，有利于发酵[17].本实验将采用混合菌种进行发酵.

图1 不同乳酸菌种发酵产酸情况

2.2 接种量对发酵的影响

图2给出采用混合乳酸菌发酵时，接种量对发酵醪中活菌数的影响.结果表明,随着接种量的增加，活菌数升高，接种量持续升高导致发酵结束时的活菌含量较低.研究表明,接种量大小影响乳酸脱氢酶的含量[18]，如果接种量过小，乳酸脱氢酶含量较低，导致发酵时间延长，接种量过大导致营养物质消耗过快，培养液黏度增大，菌体早衰，发酵后劲不足，影响发酵产量.本研究结果与此一致，图2表明接种量为0.4 g/100mL时发酵液中活菌含量约2.0×108CFU/mL，当接种量增加为1.0 g/100 mL时，发酵液中活菌含量约为0.2×108CFU/mL相差10倍，菌体早衰严重，因此，较佳接种量为0.4 %.

图2 接种量对乳酸发酵液中活菌数的影响

2.3 发酵初始pH对发酵液活菌数的影响

由图3可知，当初始pH为6.5时，发酵结束时的活菌数最大，有利于发酵.细菌细胞膜表面具有H+-ATPase，将H+泵出细胞，建立和维持跨膜的H+电化学梯度，并驱动转运溶质摄入细胞，细胞对糖和氨基酸的摄入主要是由H+驱动的同向运输完成的[19].培养液pH动态变化主要是由乳酸菌在生长过程中产生乳酸引起的，乳酸的积累影响乳酸菌的生长.乳酸是一种解偶联剂，起到使质子从培养液中进入细胞的质子泵作用，因此随着乳酸的积累，胞外与胞内的pH均下降，进而抑制乳酸菌的生长[20].当细胞内pH值下降，抑制了乳酸脱氢酶的活性，从而抑制了糖代谢途径，影响了菌体能量的获得，抑制了菌体的生长[21].而pH高于6.5时，培养基中缺乏H+，糖、氨基酸等营养物质，缺乏进入细胞的推动力，导致细胞生长不良.

图3 初始pH对乳酸发酵液中活菌数的影响

2.4 碳源种类对发酵活菌数的影响

不同乳酸菌细胞存在不同的酶系，利用的优势碳源亦不同.由图4可知,本实验选用的混合乳酸菌选白砂糖作为碳源更适合发酵.在发酵过程中白砂糖的含量起着关键作用，如果白砂糖浓度过低，不能为微生物提供充足的碳源，细菌生长慢导致乳酸产量低.但是若糖浓度过高，使培养基的渗透压增大从而抑制了菌体的生长，这种基质抑制作用导致乳酸合成也受到了影响[18].由图5可以看出，当白砂糖添加量为4 g/100 mL时有最大的活菌数.

图4 碳源种类对发酵活菌数的影响

图5 白砂糖对乳酸发酵液中活菌数的影响

2.5 氮源对发酵活菌数的影响

由于一般乳酸菌生长及其合成氨基酸、维生素、核苷酸等的能力较差，在它们的培养基中需要添加一定的氮源来满足它们的生长.氮源种类较多，硝酸钠为无机氮源不能满足要求，尿素虽为有机氮，但其成分单一，不具有有机氮的特点[13]，蛋白胨含有多种氨基酸和多肽，含糖量较低，牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类等物质，玉米浆中含有大量的氨基酸、维生素、生长因子，可促进菌体生长、有利于发酵产酸、提高糖酸转化率[22].从图6可以看出，与蛋白胨、牛肉膏相比，玉米浆更适合本实验采用的乳酸菌生长发育，而且玉米浆成本较低.

图6 氮源种类对乳酸发酵活菌数的影响

从图7可以看出，当玉米浆含量增加时体系的营养物质增加，菌体浓度增加，产酸量增加.保持碳源一定的情况下，在发酵液中进一步添加玉米浆，营养物质增加，发酵前期菌体繁殖速度加快，同时，碳源在前期迅速减少，后期碳源不足，菌种代谢受阻，繁殖缓慢.图7表明玉米浆添加量为1.0 mL/100 mL时，活菌数量较高.

图7 玉米浆添加量对发酵液中活菌数的影响

2.6 正交试验

根据单因素实验的结果，设计三水平正交实验，其因素水平表如表1所示.

表1 苹果乳酸发酵正交试验因素及水平

表2和表3分别为苹果渣乳酸发酵正交试验结果和方差分析.研究表明,苹果渣乳酸发酵条件适宜组合为A2B2C1D2，即接种量0.4 g/100 mL、蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米浆添加量0.5 g/100 mL、 pH 6.5.影响因素顺序为A﹥D﹥B﹥C，即接种量影响最大，其次是pH值，随后是蔗糖添加量，最后是玉米浆添加量.

按照发酵乳酸菌接种0.4 g/100 mL、蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米浆添加量0.5 mL/100 mL、初始pH 6.5， 做三平行验证性实验，结果表明在此条件下发酵，结束时发酵醪液中乳酸活菌数可达9.43×108CFU/mL，总酸含量为7.74 g/L.

表2 苹果乳酸发酵正交试验结果

3 结论

以苹果渣和鲜苹果为原料进行乳酸发酵，优百伦为适宜发酵剂，蔗糖为适宜碳源，而适宜氮源为玉米浆，优化后的发酵工艺条件为：初始pH 6.5，乳酸菌接种0.4 g/100 mL，蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米浆添加量0.5 mL/100 mL，在此条件下所得发酵液中活菌数为9.43×108CFU/mL，总酸为7.74 g/L，有利于乳酸饮料的生产.

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【责任编辑：陈 佳】

Optimization of apple residuelactobacillusfermentation

YANG Hui， YAN Xiao-zhe， DU Jiao-jiao

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science &Technology, Xi′an 710021, China)

In order to make full use of the apple pomace and improve the level of apple deep processing,the apple pomace and fresh apple were used as materials to extract juice in aqueous solution.Then,the extracted juice was fermented byLactobacillusto prepare a lactic acid solution.Based on criteria including total acid content and cell concentration,an ideal lactic acid bacteria was screened.And the ideal carbon source and nitrogen source for selected lactic acid strain were determined by single factor experiments based on a criteria of cell concentration.The fermentation parameters were optimized by orthogonal test design.Results show that the idea inoculums for lactic acid fermentation is yoghurt starter.The optimal fermentation conditions are the initial pH of 6.5,inoculum size of 0.4%,sucrose content 3%,corn steep liquor 0.5%.Under the conditions,the cell concentration ofLactobacilluswas more than 9.43×108CFU/mL and the total acid content is more than 7.74 g/L in the fermentation broth,which is favorite to production and development of lactic acid beverage.

apple pomace; lactic acid fermentation; fermentation starter;Lactobacillus; viable count; total acid

2016-10-29

科技部成果转化项目(2013GB2G000473)； 陕西科技大学学术带头人团队项目(2013XSD19)

杨 辉(1960-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，研究方向：生物材料和发酵工程

2096-398X(2017)03-0138-05

TS255.2

A