pSilencer 3.1-Sirt3基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

曲 璇,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

pSilencer 3.1-Sirt3基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

曲 璇*,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

目的 构建Sirt3基因的RNA干扰载体,并在真核细胞中进行pSilencer 3.1-Sirt3的功能鉴定。 方法 利用体外DNA合成技术及液相色谱纯化技术合成Sirt3干扰序列,通过酶切将干扰序列连接至pSilencer 3.1载体中,将阳性克隆载体转入感受态大肠杆菌细胞后,筛选阳性克隆,通过第二代体外DNA测序技术进行序列测定。将测序正确的克隆用于Western blot实验和real time PCR实验,以对其在真核细胞中的正确表达和内源性Sirt3的干涉效果进行鉴定。 结果 PCR扩增得到序列测定结果与干扰序列完全一致。构建的pSilencer 3.1-Sirt3质粒在AGS和SGC-7901细胞中进行基因的转染,pSilencer 3.1-Sirt3能够有效抑制内源性Sirt3的mRNA水平和蛋白质水平的表达。 结论 成功构建获得Sirt3干扰载体,并有效降低Sirt3的mRNA和蛋白质水平的表达,为今后Sirt3的功能研究提供良好的基础。

Sirtuin-3; RNA干扰; 载体构建

自从20世纪70年代在酵母中首次发现两种组蛋白去乙酰化酶以来,组蛋白乙酰化和去乙酰化的研究越来越受到关注。近年来,人们发现去乙酰化酶Sirtuin-3(Sirt3)具有依赖于NAD的组蛋白去乙酰化酶活性,能够对乙酰化的线粒体蛋白进行脱乙酰基[1-3]。目前已发现Sirt3主要定位于肝、脑、肾和心脏等富含线粒体的组织器官中[3,4],Sirt3的作用底物有AceCS2、琥珀酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶等重要的能量代谢相关酶类,这对于维持和调节线粒体的正常生理功能具有重要意义[5,6]。……