基于分子对接研究独活寄生汤作用MMP-1、MMP-3的药效物质基础

郑春松，陈春蓉，林平冬，吴广文，李西海，叶蕻芝，刘献祥

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

·实验研究·

基于分子对接研究独活寄生汤作用MMP-1、MMP-3的药效物质基础

郑春松1，2，陈春蓉2，林平冬2，吴广文2，李西海2，叶蕻芝1，刘献祥1

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

目的探索独活寄生汤作用基质金属酶-1（MMP-1）和基质金属酶-3（MMP-3）的药效物质基础。方法运用计算机模拟之分子对接技术，研究独活寄生汤中化合物与MMP-1、MMP-3的相互作用，从中筛选出比原配体与各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物。结果以MMP-1为靶点，筛选出独活寄生汤的潜在活性化合物172个，主要为苷类、黄酮类、有机酸类等化合物，其中，28个化合物也能作用于靶点MMP-3。结论以MMP-1、MMP-3为靶点，计算机模拟出独活寄生汤的药效物质基础为172个化合物，提示其可能是通过有效成分群发挥治疗骨关节炎的作用，为其骨关节炎临床使用提供依据。

独活寄生汤；骨关节炎；基质金属酶；药效物质基础；分子对接

骨关节炎（osteoarthritis，OA），是一种以关节软骨的退行性改变及继发性的骨质增生为主要病理特点的慢性退行性骨关节疾病，已成为威胁人类健康最常见的一种疾病［1］。已有研究表明，正常的关节软骨是由少量的软骨细胞和大量的软骨细胞外基质组成，其中，细胞外基质中主要含有胶原纤维和聚蛋白多糖等大分子物质。在OA中，当软骨细胞外基质的降解超过其合成时，会降低软骨基质净含量，进而引起关节软骨的部分甚至完全损耗，此为关节软骨破坏的主要病理表现［2-3］。OA患者关节软骨中基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase，MMP-1）和基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase，MMP-3）表达均显著高于正常对照组，其是导致软骨聚蛋白多糖和胶原降解的关键酶［3-4］。独活寄生汤源自唐代医家孙思邈的《备急千金要方》，由独活、细辛、防风、秦艽、肉桂和桑寄生等15味药物组成，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾和补气血的功效［5］。将其用于OA临床，能保护关节软骨，发挥缓解疼痛的的效果［6-7］。前期课题组已经研究表明，独活寄生汤含药血清可抑制IL-1β诱导的退变关节软骨细胞中MMP-1、MMP-3的表达［8］。因此，笔者运用分子对接［9-10］，寻找独活寄生汤作用MMP-1和MMP-3的药效物质基础，从分子层面为其临床治疗OA提供依据。

1 材料

1.1 实验材料独活寄生汤分子集；MMP-1和MMP-3靶点。

1.2 实验设备本研究使用北京大学化学与分子工程学院计算机模拟实验室的Discovery Studio（DS）软件进行计算，分子对接的模拟过程中涉及到的参数除非特别指明，否则均为默认值。

2 方法

2.1 配体和靶点的数据处理从《中药原植物化学成分手册》、北京大学中草药有效成分三维结构数据库和文献［10-13］，收集独活寄生汤化学成分566个，利用ISIS／Draw 2.5和DS软件，绘制其化学结构，选用MMFF力场优化，保存为sd文件，建立独活寄生汤配体分子数据集。根据OA的发病机制［14］和治疗靶数据库［15］，确定与延缓软骨退变密切相关的靶点MMP-1和MMP-3。在RCSB Protein Data Bank上［16］，下载MMP-1和MMP-3的蛋白质结构，其代码分别为3AYK和4G9L，见图1。

图1MMP-1、MMP-3的结构

2.2 分子对接和打分在DS LigandFit模块进行独活寄生汤分子集配体与OA靶点的对接工作［17］。其步骤为：①MMP-1和MMP-3结构去溶剂、去原配体、加氢处理后，用其结合的已知原配体活性化合物来确定活性位点；②使用Monte Carlo方法对独活寄生汤的化学成分配体进行构象采样、Dreiding力场下进行打分，保留得分最高的构象；③对对接成功的独活寄生汤配体化合物按DOCKSCORE高低进行排序，筛选出比原配体与各自靶蛋白作用的DOCK-SCORE高的化合物，视为独活寄生汤中的活性成分［9，18］，即独活寄生汤作用于MMP-1和MMP-3的药效物质基础。

3 结果

在DS LigandFit模块中，配体和靶点的作用遵循能量互补、几何互补以及化学环境互补等原则，寻找各自最佳的DOCK-SCORE。以蛋白结构中已知的原配体活性化合物的DOCK-SCORE为阈值，发现独活寄生汤潜在的活性成分172个，其中与MMP-1和MMP-3结合较好的化合物分别为172和28个，见表1和表2。结果显示以MMP-1、MMP-3为靶点的药效物质基础主要由苷类、黄酮类和有机酸类成分组成。

表1 以MMP-1为靶点的分子对接结果

4 讨论

方剂的药效物质基础是指中药复方中发挥治疗作用的化学成分，是阐明方剂药效作用的关键［19］。而且，其有效成分是通过与体内的生物靶点相互作用而产生药效的，药物-受体结合时，存在静电、范德华力、氢键和疏水等相互作用。这些性质可用分子模拟方法来计算［20］。分子对接计算作为最常用的分子模拟方法之一，它是将配体化合物置于受体活性位点，遵循几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则，来实时评价配体与受体相互作用的好坏，从中找到配体与受体之间最佳的结合模式，该方法在中医药研究中已有很多成功的应用。如曾茂贵等［21］利用分子对接LigandFit和Ligplot软件研究扶正抑瘤复方中槲皮素、木犀草素、芹菜素与大豆黄素对环氧化酶-2的作用，结果发现槲皮素、木犀草素、芹菜素均有氢键作用，而大豆黄素没有，从而揭示含有间二苯酚结构的化合物更有可能对环氧化酶-2起作用。此外，龙伟等［22-24］也成功应用分子对接技术揭示了黄连解毒汤、青风藤、白芷的药效物质基础。中药复方是天然组合化学库，如果应用“中药到活性成分”的传统途径来研究中药的药效物质基础，常常会出现筛选时间较长、假阳性的干扰、漏筛的缺点［25－26］。因此，本文将独活寄生汤看作组合化合物库，运用分子对接研究其药效物质基础。

表2 以MMP-3为靶点的分子对接结果

OA的特点是关节软骨的进行性破坏，而MMPs的表达异常，会降解关节软骨细胞外基质，引起关节软骨肿胀，抵抗外力作用下降，进而造成关节软骨的进行性破坏［1，27］。其中，MMP-1和MMP-3在OA退变软骨中高表达，前者可使Ⅱ型胶原变性裂解，后者对蛋白聚糖有高度的裂解变性，还可激活前者，加速胶原的降解，使软骨降解退变加剧［27-28］，提示MMP-1和MMP-3在关节软骨的进行性破坏中起到重要作用。而且，治疗肝肾亏虚、风湿痹阻痹证最常用且有效的古方独活寄生汤已经证实能介导Wnt／β-catenin-BMP信号通路，能延缓关节软骨的退行性病变［7，29］。由此本研究以MMP-1和MMP-3为靶点，以独活寄生汤为研究对象，借助分子对接平台，开展独活寄生汤的药效物质基础研究。表1和表2显示独活寄生汤中黄酮类（扁蓄苷、异槲皮苷等）、苷类（大叶苷D、地黄苷A等）、有机酸（绿原酸、京尼平苷酸等）等化合物能与MMP-1、MMP-3有很好的作用。有些化合物活性文献已经报道［30］，如绿原酸对高强度运动引起的膝关节软骨损伤的保护作用等。因此，独活寄生汤作用于MMP-1和MMP-3的药效物质基础为苷类、黄酮类和有机酸等组成的有效成分群，是未来我们开展独活寄生汤治疗OA的重点研究对象。

总之，本实验从“活性成分到中药”的反向途径出发，建立了独活寄生汤的化学成分分子数据集，以MMP-1和MMP-3为靶点来建立OA软骨退变的虚拟药理模型，借助分子对接平台，研究了独活寄生汤的药效物质基础。但该实验也存在2个不足：①由于现有文献对方中药材的成分研究的局限，造成有些药材的成分不全，进而无法阐释各组成药材在独活寄生汤复方中所各自起到的作用；②由于本研究的靶点仅局限于软骨退变，进而无法揭示独活寄生汤中对于OA的治疗起着关键性作用的化合物分子。后续本课题组将根据国内外学者对独活寄生汤中各药材成分的陆续报道，进一步完善其配体分子数据集，也会增加OA的靶点数目，开展独活寄生汤治疗OA的网络药理学研究［31］，无疑有助于解决以上问题。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0037-03

2017-03-23

福建省自然科学基金项目（2015J01338），福建省中青年教师教育科研项目（JA14152）

郑春松（1982—），男，医学博士，主要从事骨关节炎研究。