电针后血清对大鼠成骨细胞增殖活性的影响

吴追乐，邱美榕

电针后血清对大鼠成骨细胞增殖活性的影响

吴追乐1，邱美榕2

（1.福建中医药大学针灸学院，福建福州350122；2.福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的观察电针后血清对大鼠成骨细胞增殖活性的影响。方法取30只SD雌性大鼠按抽签法随机分为空白组、雌二醇组、电针组，每组各10只。空白组不做任何处理；雌二醇组以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，每周1次，连续90 d；电针组取穴大杼（BL11）、命门（DU4）、足三里（ST36），电针干预15 min，每日1次，10次为1个疗程，疗程间休息5 d，共干预6个疗程，持续90 d。90 d后，每组腹主动脉采血制备血清。另外，将新生24 h SD乳鼠麻醉断头处死，取下颅盖骨，建立成骨细胞体外培养体系，培养至第3代时同步化后进行干预，采用MTT法分别确定电针后血清的有效干预时间及干预浓度。空白组、雌二醇组、电针组分别在有效浓度作用下干预成骨细胞，在有效干预时间点采用MTT法观察成骨细胞的增殖。结果与24、48、96 h比较，干预72 h成骨细胞OD值高于其它3个时间点，差异有统计学意义（P＜0.05）；10%电针后血清浓度组明显高于5%、20%血清浓度组，差异有统计学意义（P＜0.01）。在10%血清浓度的作用下干预72 h，电针组第3代成骨细胞OD值高于雌二醇组（P＜0.05）。结论电针后血清能加速成骨细胞增殖，维持成骨细胞活性。

骨质疏松症；电针；血清；成骨细胞；细胞活性

骨质疏松症（osteoporosis，OP）属中医“骨痿”范畴，按照中医“肾主骨生髓”的理论，肾虚是OP发病的首要病因［1］。目前医学研究证实，中医学的肾虚证与下丘脑-垂体-性腺轴功能降低密切相关，针灸可针对此轴的功能进行良性调节，稳定体内雌激素的水平，从而抑制骨吸收，增强骨形成，达到治疗OP的作用［2］。前期研究证实，针刺能减少骨丢失，改善骨强度和超微结构，对OP有防治作用［3-7］。本研究以“肾主骨”“骨会大杼”“肾为先天之本，脾为后天之本”理论为指导，以补肾健脾、温阳通脉、强筋壮骨为治疗原则，精选大杼（BL11）、命门（DU4）、足三里穴（ST36）治疗。大杼（BL11）为八会穴之一，骨会大杼（BL11），强筋壮骨；命门（DU4）可培元补肾，强健腰膝（补先天）；足三里（ST36）有温阳益气，健脾益胃（补后天）之功效。将电针后血清引入成骨细胞增殖的研究中，观察电针后血清影响成骨细胞增殖活性的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物选用3月龄SD雌性大鼠30只，用于制备电针后血清；新生24 h的SD乳鼠10只，用于成骨细胞的培养和传代。动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号：SCKK（沪）2012-0002］。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级实验动物环境及相关设施［许可证号：SYXK（闽）2014－ 0005］。所有实验动物均严格按照国家机构关于实验动物卫生指导使用及符合国际伦理准则，实验获得福建中医药大学动物保护委员会批准。

1.2 试剂和仪器Ⅰ型胶原酶（Invitrogen公司）；小牛血清-FBS、胰蛋白酶、DMEM培养液（Hyclone公司）；MTT﹑DMSO（Sigma公司）；戊酸雌二醇（广州先灵药业有限公司；批号：230B）。GBB16二氧化碳培养箱（上海力新实业有限公司）；SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；ELX800酶标仪（美国BIO-Tek公司）；IX 70倒置式系统显微镜（日本太阳交易株式会社）；0.30 mm×13 mm毫针、电针仪（华佗SDZ-V；苏州医疗用品厂有限公司）。

2 实验方法

2.1 电针后血清的制备3月龄SD雌性大鼠30只，按抽签法随机分为3组，即：空白组、雌二醇组、电针组，每组各10只。空白组不做任何处理；雌二醇组以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，按人鼠剂量换算，每只鼠每次肌注0.1 mg／kg，每周1次，连续90 d；电针组取穴大杼（BL11）、命门（DU4）、足三里（ST36），穴位常规消毒，毫针进针，采用提插捻转行针手法，使用电针仪（脉冲强度10V，脉冲频率8 Hz，连续波）进行电针干预15 min［8］，每日1次，10次为1个疗程，疗程间休息5 d，共干预6个疗程，持续90 d。各组SD大鼠采血前禁食12 h，均于第90 d末次针刺1 h后在水合氯醛麻醉状态下进行腹主动脉采血4～5 mL，分别单独装瓶。在离心机下以3000 r／min离心15 min，分离血清，恒温水浴锅56℃水浴，灭活30 min，经0.22 μm滤膜抽滤除菌，分装，－20℃冰箱保存备用。

2.2 成骨细胞的培养将新生24 h的SD乳鼠麻醉后断头处死，无菌操作，切开皮肤及皮下组织，切下颅盖骨，浸泡于DMEM培养液中，去除周围软组织、血管及骨膜，0.01 mol／L磷酸盐缓冲液反复冲洗2次，剪成1 mm×1 mm大小置于25 mL培养瓶中，于37℃下，用2.5 g／L胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶混合液（1∶1）预消化20 min，弃消化液。再用Ⅰ型胶原酶消化，每20 min轻摇培养瓶1 min，消化2 h后用400目不锈钢滤网收集消化液，去除骨片，用等体积的15%FBS DMEM培养液稀释，余渣再加入Ⅰ型胶原酶消化1次，步骤同上，将2次收集的消化液1000 r／min离心5 min，弃上清，用15%FBS DMEM培养液重悬成骨细胞沉淀，按一定密度置于37℃、5%CO2饱和湿度二氧化碳培养箱内接种培养，并根据细胞的接种密度进行消化传代。本实验采用经2次传代、纯化的第3代细胞，并根据不同步骤的需要将细胞调整成适当的密度。

2.3 建立干预成骨细胞活性时效关系及量效关系

2.3.1 电针后血清干预成骨细胞活性时效关系第3代成骨细胞以2×103／孔接种于96孔板中，含10%FBS DMEM培养24 h。用不含10%FBS DMEM培养24 h同步化成骨细胞，分别加入含10%空白组、电针组的血清DMEM培养，每组成骨细胞设定6孔，分别培养24、48、72、96 h。弃培养液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃温育4 h，弃MTT溶液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振荡10 min，酶标仪λ570 nm检测每孔OD值。

2.3.2 电针后血清干预成骨细胞活性量效关系第3代成骨细胞以2×103／孔接种于96孔板中，含10%FBS DMEM培养24 h。用不含10%FBS DMEM培养24 h同步化成骨细胞，分别加入含5%、10%、15%、20%的空白组、电针组的血清DMEM培养，每组成骨细胞设定6孔，培养72 h。弃培养液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃温育4 h，弃MTT溶液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振荡10 min，酶标仪λ570 nm检测每孔OD值。

2.4 电针后血清对成骨细胞增殖的影响第3代成骨细胞以2×103／孔接种于96孔板中，含10%FBS DMEM培养24 h。用不含10%FBS DMEM培养24 h同步化成骨细胞，分别加入含10%空白组、雌二醇组、电针组的血清DMEM培养，每组成骨细胞设定6孔，培养72 h。弃培养液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃温育4 h，弃MTT溶液，100 μL PBS（1×）冲洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振荡10 min，酶标仪λ570 nm检测每孔OD值。

2.5 统计学方法采用SPSS 14.0软件进行统计学处理，数据以（x±s）表示，计量资料采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 成骨细胞的形态学观察原代细胞培养第1 d可见大部分在培养液中悬浮，胞体圆形，核大，见图1A；2 d时细胞完全贴壁，胞体呈三角形、多角形等，核呈卵圆形，见图1B；5 d时细胞分裂明显增加，突起紧密连接，呈集落生长，似鱼鳞状，见图1C；7 d时可见细胞形态多样，重叠生长，胞浆丰富，呈铺石状，符合成骨细胞的形态学特征，见图1D。当达到80%汇合时消化传代，消化后弃去组织块，传代后2 h倒置显微镜观察，部分细胞开始贴壁，细胞呈多边形、纺锤形、梭形，胞核较大，呈圆形且清晰。24 h后细胞大部分贴壁生长，排列紧密，多呈梭形和多边形。随时间推移，细胞重叠生长，数量增加，经反复消化、传代后得到纯化的成骨细胞。

3.2 时效及量效关系的建立

3.2.1 建立时效关系第3代成骨细胞，空白组OD值，干预72、96 h明显高于干预前（P＜0.05）；电针组OD值干预72 h明显高于其它3个时间点（P＜0.05）。因此确定72 h作为后续成骨细胞实验的最佳检测时间点，见表1。

3.2.2 建立量效关系第3代成骨细胞，干预后，2组OD值，10%、15%、20%均明显高于5%（P＜0.01）；电针组，10%与15%比较无统计学差异（P＞0.05），但随着血清浓度的进一步增加，成骨细胞OD值明显降低。因此确定10%血清浓度作为最佳干预浓度，见表2。

3.3 成骨细胞增殖的影响见表3。

4 讨论

4.1 电针后血清建立的理论依据近年来，中医药在治疗OP方面进展很大，具有疗效稳定、作用广泛、使用安全、毒副作用小的特点，发展前景良好。针灸属于祖国传统医学的特色疗法，是一种“自然疗法”“整体疗法”，疗效确切，无不良反应，能充分调动机体的自我调节能力。研究证实，针灸对生殖内分泌系统具有调节作用，可明显提高雌二醇［9-11］。另外，电针具有消肿止痛、舒筋活络、补肾壮骨益髓的作用，多层面、多靶点、多途径作用于经络系统，经过中枢神经系统的整合及信号通路的调控，调节细胞的增殖、分化、凋亡及机体的免疫应答反应，从而进一步改善患者的临床症状和体征［12］。

图1 成骨细胞的形态学观察

表1 电针后血清干预成骨细胞活性的时效关系（OD值，x±s）

表2 电针后血清干预成骨细胞活性的量效关系（OD值，x±s）

表3 电针后血清对成骨细胞增殖影响（x±s）

针灸调整内分泌免疫系统的研究一直是中医针灸科研领域的重点课题，从神经体液角度入手的研究较多，主要探讨针灸作用的神经机制，欠缺体液机制的探讨，直接证据获得较少。而针灸调整内分泌免疫系统研究的数据，大多数来源于在体实验的研究。在体实验研究中，针灸可对血清中某些相关活性成分的水平进行不同程度的调节，所获得的数据大部分是通过间接观察得到的结果。因此，针灸专家陈汉平教授提出“针灸血清”的方法，很大程度上提高了针灸科研的观察水平。其要领是把针灸治疗后获取的血清直接加入到体外反应体系中进行干预，通过对离体靶器官、组织、细胞等形态结构和功能活动的观察，分析针灸血清所产生的具体效应［13-15］。

现代医学认为，OP的主要病理变化是在骨代谢过程中骨形成和骨吸收的偶联产生缺陷，致使人体内钙磷代谢失衡，进而骨量逐步减少而引发相关临床症状。人体的骨代谢，一方面是成骨细胞的骨形成，另一方面是破骨细胞的骨吸收，两者之间协调平衡，从而使体内的骨转换处于正常水平状态。因此任何影响破骨细胞和成骨细胞功能和（或）数量的因素，使骨吸收过多或骨形成不足，均可出现骨质疏松。成骨细胞是骨形成的关键细胞，骨代谢正常与否与成骨细胞的分化成熟、功能活性密切相关。尽管目前骨质疏松症的发病机制仍不清楚，但研究表明，骨质疏松发病过程中，成骨细胞数量减少，骨形成不足，与成骨细胞增殖分化水平下降及成骨能力功能障碍有着密切的关系［16-17］。

因此，本研究根据人体与动物药物等效剂量换算，制备了电针后血清。采用电针后血清作用于体外培养的成骨细胞，模拟电针的经络调节过程，为后续开展成骨细胞增殖、维持成骨细胞活性提供有效的实验平台。

4.2 成骨细胞增殖方法及意义本研究首先采用梯度时间法、梯度浓度法建立电针后血清干预成骨细胞活性的时效及量效关系，结果表明，成骨细胞干预72 h为最佳干预时间点，10%血清浓度为最佳干预浓度。成骨细胞在电针后10%血清浓度的作用下干预72 h，检测成骨细胞增殖情况的结果表明，电针组比雌二醇组更能促进成骨细胞增殖。

电针后血清能加速成骨细胞增殖，维持成骨细胞活性，但随着干预时间的延长，其维持成骨细胞活性的能力具有自限性，96 h后效果欠佳，这可能是由于96 h后软骨细胞营养物质缺乏，代谢产物堆积，细胞进入平台期并开始衰退。众所周知，骨形成是一个极其复杂的过程，成骨细胞是骨形成的关键细胞，电针是如何促进成骨细胞的增殖？是否电针后导致雌激素水平上升从而加速成骨细胞的增殖？通过何种途径激活细胞增殖相应的信号通路？信号通路之间又是如何相互影响的？这些问题有待于今后进一步研究和探讨。

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R245

B

1000-338X（2017）03-0040-04

2016-04-03

福建省自然科学基金资助项目（2015J05161）；福建省卫生计生委青年科研课题（2015-1-78）；福建中医药大学校管课题（X2012021）

吴追乐（1982—），男，医学博士，主要从事针灸治疗骨质疏松的研究。