缺氧对血府逐瘀胶囊促血管新生影响的研究

蔡飞，苏晓艳，王鹤，秦崇涛，宋军，高冬

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122；2.中国中医科学院医学实验中心，北京100700）

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缺氧对血府逐瘀胶囊促血管新生影响的研究

蔡飞1，苏晓艳2，王鹤1，秦崇涛1，宋军2，高冬1

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122；2.中国中医科学院医学实验中心，北京100700）

目的研究血府逐瘀胶囊在缺氧条件下对血管新生的影响。方法通过观察血府逐瘀胶囊含药血清在缺氧条件下对HMEC-1细胞的活力、增殖能力、黏附能力、迁移能力和体外成血管能力的影响，明确缺氧条件对药物促血管新生作用的影响。结果缺氧条件下含药血清在低浓度早、中期增加HMEC-1细胞活力，提高迁移及黏附能力；中、高浓度含药血清早期促进血管管腔形成，随后促管腔形成作用消失。结论缺氧条件下血府逐瘀胶囊通过影响HMEC-1细胞活力、迁移、黏附能力等环节来保护血管内皮细胞，促进血管新生。

血府逐瘀胶囊；血管新生；缺氧

缺血性疾病系由各种原因导致动脉或静脉的血流不足或中断，致使相应的组织和器官出现不同程度的缺氧缺血损伤，而产生临床上相对应的组织、器官、神经等功能缺失的表现。近年来，缺血性疾病严重危害着人类健康，血管新生在缺血性疾病的治疗和愈后中意义重大［1］。血管新生通常发生在营养不足或缺血缺氧等病理条件下，因此本实验意在通过在缺氧培养条件下，观察血府逐瘀胶囊含药血清对人微血管内皮细胞HMEC-1活力、增殖、黏附、迁移和形成管腔的影响，探讨血府逐瘀胶囊在缺氧条件下对血管新生的影响及其促血管生长的行为特征，从细胞水平明确药物促进血管新生的作用机制，也为血府逐瘀胶囊的临床使用提供有力的科学理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物及细胞株SPF级SD雄性大鼠40只，6周龄，体重（150±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（NO.0037614），由福建中医药大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2009-0001］饲养。HMEC-1细胞株由中科院上海药物研究所丁健院士惠赠。

1.2 实验药物血府逐瘀胶囊由天津宏仁堂药业有限公司生产，0.4 g／粒，药品批号为A03149。用生理盐水溶解配制成浓度为0.041 g／mL的药液。

1.3 试剂及仪器胎牛血清（FBS，美国GIBCO公司），体外血管生成试剂盒（美国Millipore公司），循环测试DNA试剂盒（美国BD公司），MCDB-131培养基（美国GIBCO公司），MTT（美国Sigma公司），结晶紫细胞群落染色试剂盒（上海捷美基因公司），DMSO（北京Solarbio公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），8000系列水套三气厌氧培养箱（美国Thermo scientific），IX70倒置相差显微镜及数码摄像装置（日本Olympus公司）。

2 实验方法

2.1 实验动物分组和含药血清制备SPF级SD雄性大鼠40只，随机分为药物组和空白组，每组20只。药物组以血府逐瘀胶囊药液灌胃，给药剂量为每天0.41 g／kg，相当于临床常用剂量的2倍；空白组以等量生理盐水灌胃。连续灌胃7天，2次／天，第8天灌胃后2 h腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴锅灭活，过滤除菌，分装，置于-20℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养将HMEC－1细胞培养于含10% FBS的MCDB-131培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.3 实验分组干预接种4 h细胞贴壁后更换含不同浓度的空白血清和含药血清MCDB-131培养液，具体干预分组如下：1.25%、2.5%、5%含药血清组与1.25%、2.5%、5%空白血清组，置于缺氧培养箱中培养24 h、48 h、72 h后开展各项实验。

2.4MTT实验按0.5×104个／mL接种于96孔细胞培养板，分组干预后，置缺氧培养箱培养24 h、48 h、72 h，每孔加入5 mg／mL的MTT溶液20 μL，置于原培养条件4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，置于主波长为570 nm、参比波长为630 nm的酶标仪中，测定各孔的吸光度值（OD值）。每组设为6个平行孔，重复3次。

2.5 细胞周期检测按5×105个／mL接种于直径10 cm的培养皿中，分组干预后，置缺氧培养箱培养24 h、48 h、72 h，根据循环测试DNA试剂盒说明书操作。使用FACSCAN流式细胞仪检测处于S期细胞所占比例，ModiFit软件分析。实验重复3次。

2.6 细胞黏附实验按2×105个／mL细胞密度接种于6孔细胞培养板，分组干预后，置缺氧培养箱中培养24 h、48 h、72 h，胰酶消化收集，稀释至2× 104个／mL的细胞密度，毎孔100 μL接种于96孔细胞培养板，原培养条件培养1 h后，弃培养液，按照结晶紫细胞群落染色试剂盒说明书操作，固定15 min，染色20 min，晾干后拍照，计数黏附的细胞。每组设有6个平行孔，实验重复3次。

2.7 细胞迁移实验按2×105个／mL细胞密度接种于6孔细胞培养板，分组干预后，置缺氧培养箱中培养24 h、48 h、72 h。①在Transwell室孔中加入培养液，37℃、5%CO2培养箱培养1 h；②取出缺氧培养箱中细胞，弃原培养液，消化收集成单细胞悬液，稀释为2×105个／mL的细胞悬浮液；③将细胞悬浮液按100 μL／室加入至培养1 h后的Transwell小室，置缺氧培养箱培养12 h后，取出Transwell小室，按结晶紫细胞群落染色试剂盒说明书操作，计数迁移的细胞数量。每组设有3个小室，实验重复3次。

2.8 体外成血管实验按2×105个／mL细胞密度接种于6孔细胞培养板，分组干预后，置缺氧培养箱中培养24 h、48 h、72 h，按体外血管生成试剂盒说明书操作后，置于缺氧培养箱中培养4 h，拍照，计数管腔形成数。设3个平行孔，实验重复3次。

2.9 统计学方法所有实验数据用SPSS 22.0软件分析处理，计量资料用（x±s）表示，采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 缺氧对细胞活力影响比较缺氧条件下低浓度含药血清短时间能显著增加细胞活力，见表1。

表1 缺氧对细胞活力影响比较（x±s，n＝6）

3.2 缺氧对细胞增殖能力比较缺氧条件下，药物对细胞增殖没有影响，见表2。

3.3 缺氧对细胞迁移情况比较在缺氧条件下，药物低浓度早期促进细胞迁移，中浓度先抑制后促进细胞迁移，而高浓度中期促进细胞迁移，最终作用消失，见表3。

3.4 缺氧对细胞黏附情况比较在缺氧条件下，中浓度药物促进细胞黏附，高浓度抑制细胞黏附，见表4。

表2 缺氧对细胞增殖能力比较（x±s，n＝3）

表3 缺氧对细胞迁移情况比较（x±s，n＝6）

表4 缺氧对细胞黏附情况比较（x±s，n＝6）

3.5 缺氧对细胞体外血管腔形成能力比较在缺氧环境下，中、高浓度血府逐瘀胶囊能够在作用较早期促进血管管腔形成，随后促管腔形成作用消失，见表5。

表5 缺氧对细胞体外血管腔形成能力比较（x±s，n＝18）

4 讨论

血府逐瘀汤是清代医家王清任活血化瘀法最具代表性的方剂。该方由桃仁、红花、生地、当归等11味中药组成，血府逐瘀胶囊是按照该药物组成而生产的胶囊制剂，目前在临床上被广泛用于各种缺血性疾病的防治［2］，如冠心病、缺血性脑血管病、动脉粥样硬化等，还用于辅助治疗肿瘤［3］。早期药理学研究表明，血府逐瘀汤可改变血液凝固性和血液流变性，具有舒张血管、降低血管阻力、改善毛细血管通透性、保护心肌细胞等多种药理作用［4］。因此，我们在此基础上开展的系列研究发现，高剂量的血府逐瘀汤通过NO诱导内皮祖细胞迁移至缺血区，发挥促血管新生的作用，改善了局部缺血坏死的状况，避免了患肢出现肌肉萎缩［5］。而本实验从体外细胞模型发现在缺氧条件下血府逐瘀胶囊可以增加HMEC-1细胞活性，提高细胞迁移、黏附和体外血管腔形成能力，通过多环节调节血管新生，为血府逐瘀胶囊治疗缺血性疾病的临床运用提供了细胞水平的作用机制以及更多的实验依据。

本课题组前期开展了一系列血府逐瘀汤在常氧条件下促血管生长的实验研究，结合本实验缺氧条件的研究，进一步肯定了药物促血管新生的作用，而且更全面丰富了药物影响血管生长的认识。通过比较本实验缺氧条件与前期非缺氧条件的细胞实验结果［6-7］，我们发现缺氧条件下1.25%药物血清作用24 h、48 h可增强细胞活力，而常氧条件下药物增强细胞活力仅发生在2.5%浓度作用48 h。另外，缺氧条件下1.25%药物血清作用24 h、2.5%浓度作用48 h、72 h和5%浓度作用48 h，均可促进细胞迁移，而常氧条件下含药血清促进细胞迁移发生在2.5%、5%浓度作用48 h，说明药物在缺氧条件下对细胞活性和迁移的促进作用出现在更低浓度和更早的作用时间。缺氧条件下2.5%和5%含药血清仅在干预24 h出现短暂的促血管形成的作用，而常氧条件下药效时间点推迟到48 h，且高浓度5%含药血清干预72 h会抑制血管形成，表现出短暂促血管生长以及对血管生长的双向调节作用。上述结果提示药物只能短暂地促血管生长，且其作用方式与生理条件的变化密切相关。

另外研究发现缺氧会造成细胞凋亡率增加［8-10］，细胞形态发生改变，出现坏死，活性降低［11］，并可抑制细胞增殖［8，11］。石晓明等［12］还发现低氧处理ECV304细胞24 h、48 h、72 h，处于G0／G1期的细胞均显著增加，S期细胞明显减少，在抑制细胞增殖的同时还抑制细胞迁移和体外形成血管腔［13］。在大鼠心肌微血管内皮细胞进行缺氧处理也发现相同的实验结果［14］。这些实验说明缺氧会抑制细胞的活力，增殖、迁移、黏附及管腔形成能力，而本实验结果血府逐瘀胶囊增强细胞的活力，促进细胞迁移、黏附和管腔的形成，并消除缺氧对细胞增殖的抑制作用，从侧面说明了血府逐瘀胶囊在缺氧条件下对血管内皮细胞的保护作用，显示出血府逐瘀胶囊用于各种缺血性疾病的防治的优点。目前对于缺氧与血管新生的研究显示，在缺氧条件下VEGF［15-16］、腺苷［17］、HIF、趋化因子等调控因子及其介导的如：Notch／Dll4、cAMP-PKA-CREB等信号通路都与血管新生密切相关，但是在缺氧条件下血府逐瘀胶囊促血管新生作用机制是否也与这些因素相关，还需要我们进一步深入研究，以加深药物对血管新生调控作用的认识。

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R285.5

B

1000-338X（2017）03-0051-03

2017-03-06

国家自然科学基金资助项目（81173431）

蔡飞（1991—），男，2014级中西医结合基础专业硕士研究生。

高冬（1967—），女，教授，主要从事血管新生研究。E-mail：gd1026@yahoo.com