扶脾化瘤饮对人胃癌裸鼠移植瘤生长及TNF、NK活性的影响*

杨 洁,杨承祖,宋延平,姜姗姗

陕西省中医药研究院(西安 710003 )

·实验研究·

扶脾化瘤饮对人胃癌裸鼠移植瘤生长及TNF、NK活性的影响*

杨 洁,杨承祖,宋延平,姜姗姗

陕西省中医药研究院(西安 710003 )

目的：观察中药复方扶脾化瘤饮对荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生长及对荷瘤裸鼠TNF、NK活性的影响。方法：建立人胃癌SGC-7901细胞BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型，随机分为5组，每组8只。荷瘤对照组予纯净水灌胃，扶脾化瘤饮大、中、小剂量组予扶脾化瘤饮煎剂灌胃，20ml/kg，1次/d；阳性对照组予环磷酰胺灌胃，20mg/kg，1次/d。观察各组裸鼠移植瘤生长情况，采用L929细胞杀伤实验检测TNF活性及NK细胞活性。结果：扶脾化瘤饮大、中剂量对荷人胃癌SGC-7901裸鼠具有显著的抑瘤作用，抑瘤率为44.46%、35.79%(P<0.01,P<0.05)，同时能显著促进产生TNF，细胞毒指数分别为55.53%、52.52%(P<0.01)；扶脾化瘤饮大剂量对脾脏NK细胞活性也有提高作用，细胞杀伤率为30.59%(P<0.05)。结论：扶脾化瘤饮可以抑制人胃癌SGC-7901的生长，且能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制。

扶脾化瘤饮是治疗中晚期胃癌及转移性胃癌的经验用方，临床疗效确切，临床也用于放疗、化疗的辅助治疗[1]。为研究其抗肿瘤作用及免疫学方面可能的机制，我们观察了该方对荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生长及对肿瘤坏死因子TNF及脾脏NK细胞活性的影响。

材料与方法

1 动物和瘤株 BALB/C裸鼠，SPF级，4～6周龄，实验动物质量许可证号：SCXK(湘)2009-0004；人胃癌SGC-7901细胞株，从解放军第四军医大学实验动物中心购入。

2 试 药 扶脾化瘤饮，由陕西省中医医院药剂科生产，批号1210801；阳性药环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：12080321。

3 试验条件 室温22～28℃，相对湿度40～60%，空调调温，排气扇通风换气每天2次，每次1 h。试验小鼠雌雄分笼喂养，水(纯净水)、标准颗粒饲料自由摄取。鼠舍保持整洁卫生。光/暗时间为12/12 h。

4 仪 器 电子天平，型号：BS210S，精确度：0.1 mg，北京赛多利斯天平厂；普通光学显微镜，日本olympus；SW-CJ-IF型超净工作台，苏州净化设备有限公司；酶标仪，美国伯乐(Bio-Rad)；CO2恒温培养箱，美国SHELDON公司。

5 肿瘤动物模型制作 细胞培养及接种[2-3]：将人胃癌细胞株SGC-7901在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，待细胞长满后用胰酶消化，收集细胞进行细胞计数，将细胞悬液浓度调至1×107个细胞/ml。取3只BALB/C无胸腺裸鼠，以0.2 ml/只的剂量将瘤液接种于背部。待裸鼠背部肿瘤长至体积约为1000 mm3时进行移植。

肿瘤移植：脱颈椎处死裸鼠，消毒后将背部皮肤切开，取出肿瘤，置于放入少许细胞培养液的无菌平皿内，清除外周血管及结缔组织后切成小块，用无菌玻璃匀浆器进行研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水调整细胞浓度为1×107个细胞/ml。取40只BALB/C无胸腺裸鼠，以0.2 ml/只剂量分别接种于裸鼠右前肢腋窝皮下。接种过程须在30 min内完成。

6 实验分组及给药 待荷瘤裸鼠的瘤块体积长至约100～300 mm3后，将其随机分为五组: 荷瘤对照组、阳性对照组、扶脾化瘤饮大、中、小剂量组，每组8只。荷瘤对照组灌胃纯水，阳性对照组灌胃环磷酰胺(20 mg/kg)，扶脾化瘤饮大、中、小剂量分别灌胃剂量为6.0 g/kg、3.0 g/kg、1.5 g/kg。各组灌胃体积均为20 ml/kg，接种次日起每天给药1次，连续给药14 d。

7 观察指标

7.1 肿瘤抑制率:末次给药1 h后，称重、脱颈椎处死裸鼠，剥离瘤块称重，按公式计算抑瘤率：肿瘤抑制率=[(模型对照组瘤重-给药组瘤重)/模型对照组瘤重]×100%。

7.2 肿瘤坏死因子(TNF)活性测定[2-3]:末次给药1 h后，称重、脱颈椎处死裸鼠，摘取并研磨脾脏，裂解红细胞，将离心得到的淋巴细胞冲洗1次，离心，用培养液调细胞浓度为5×106/ml，即为脾细胞备用液。用培养液将部分备用液细胞浓度调整为1×106/ml，接种于24孔培养板，500 μl/孔，再加入5 μg/ml的ConA，500 μl/孔，在37℃、5%CO2培养箱内培养48 h后，吸出细胞培养上清，1500 r/min离心15 min，取上清液备用。

将生长良好的靶细胞L929经胰酶消化后，用培养液配制成4×105/ml的浓度，接种于96孔培养板。每只小鼠脾细胞悬液均设5复孔，加入效应细胞和靶细胞各100 μl，另设1孔为效应细胞对照，加入效应细胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。于37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48h后，吸去上清液100 μl，加入MTT(1 mg/ml)试液 100 μl，CO2培养箱内培养2 h后，2000 r/min离心5 min，吸弃上清液，每孔加DMSO 100 μl，作用30 min，用酶标仪测570 nm处的OD值。按公式计算TNF 细胞毒指数。TNF 细胞毒指数=[(靶细胞OD值-实验组OD值)/ 靶细胞OD值]×100%。

7.3 NK细胞活性测定[2-3]:将制备的脾细胞备用液浓度调为3.0×106/ml，靶细胞L929浓度调为1.2×105/ml，两种细胞接种于96孔培养板。每只小鼠脾细胞悬液均设5复孔，加入效应细胞和靶细胞各100 μl，另设1孔为效应细胞对照，加入效应细胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。同时设靶细胞对照，加入靶细胞和RPMI-1640各100 μl。于37 ℃、 5%CO2条件下杀伤20 h后，弃上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)试液10 μl,继续培养4 h,弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min，用酶标仪测定570 nm处OD值，按公式计算NK细胞杀伤率。NK细胞杀伤率=[(靶细胞OD值-实验组OD值)/ 靶细胞OD值]×100%。

结 果

1 体内抑瘤作用 扶脾化瘤饮6.0 g/kg、3.0 g/kg剂量能明显抑制荷人胃癌SGC-7901裸鼠瘤体的生长(P<0.01，P<0.05)，抑瘤率分别达到44.46%、35.79%；阳性药环磷酰胺平均抑瘤为71.35%。提示扶脾化瘤饮对荷人胃癌SGC-7901裸鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用,见表1。

表1 扶脾化瘤饮对荷人胃癌SGC-7901裸鼠肿瘤生长的影响

注：与荷瘤对照组相比,*P<0.05 ； △P<0.01

2 TNF活性测定结果 扶脾化瘤饮6.0g/kg、3.0g/kg与荷瘤对照组比较TNF明显升高 (P<0.01)，环磷酰胺组与荷瘤对照组比较，具有降低TNF活性的作用。提示扶脾化瘤饮具有增强小鼠脾脏TNF活性的作用,见表2。

表2 扶脾化瘤饮对荷胃癌SGC-7901裸鼠TNF活性的影响

注：与荷瘤对照组相比,△P<0.05

3 NK细胞活性测定结果 扶脾化瘤饮6.0g/kg与荷瘤对照组比较NK明显升高(P<0.05)，环磷酰胺组与荷瘤对照组比较NK有所降低。提示扶脾化瘤饮具有增强NK细胞活性作用,见表3。

表3 扶脾化瘤饮对荷胃癌SGC-7901裸鼠NK细胞活性的影响

注：与荷瘤对照组相比,*P<0.05

讨 论

肿瘤患者多处于免疫抑制状态，免疫调节功能水平显著低下。肿瘤的发生、发展及预后和患者的免疫状态关系十分密切，加之手术、放化疗等常规治疗使免疫功能受损愈加严重，骨髓抑制影响疗效。近年来中医药治疗胃癌研究取得一定进展，在西医常规治疗基础上配合中医药治疗能有效提高患者生存期，抑制瘤体生长及提高免疫功能[4-6]。扶脾化瘤饮以益气健脾、化痰散结为法，全方重用炙黄芪、党参、炒白术、半夏、枳壳、厚朴等药材，主治由脾气虚弱、湿滞中焦、痰瘀互结所致的胃癌。与单纯西医常规治疗相比，本方能有效提高患者生存期及生活质量、提高机体免疫功能、改善临床症状[1]。前期实验结果表明本方还具有抑制S180瘤体生长，明显改善术后及放化疗患者临床症状，提高外周血白细胞减少情况的疗效[7]。

本实验采用人胃癌SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型动态观察扶脾化瘤饮对胃癌肿瘤生长的影响，结果显示经扶脾化瘤饮作用后，SGC-7901胃癌生长受到明显抑制，与对照组比较具有明显差异，提示益气健脾、化痰散结中药制剂扶脾化瘤饮可以有效抑制胃癌生长。L929细胞杀伤实验检测TNF活性及NK细胞活性结果显示：扶脾化瘤饮能显著促进产生TNF,同时对脾脏NK活性也有提高作用，能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制，推测扶脾化瘤饮通过激活体内巨噬细胞，释放出细胞因子而实现抗肿瘤的功效。

[1] 屈小元,杨承祖.扶脾化瘤饮治疗脾胃虚弱型中晚期胃癌32例[J].陕西中医,2010，31(1)：9-10.

[2] 张晓双,孙建宁,宋延平,等.复方乌骨藤胶囊对Lewis肺癌小鼠TNF-α,NK活性的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(6):220-223.

[3] 郭建华.胡桃楸提取物的抑瘤作用及其抑瘤机理的研究[C].吉林大学,2005.

[4] 沈克平,王海永,胡 兵,等.健脾解毒中药胃肠安对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长及ERK1/2表达作用[J].辽宁中医杂志,2012,39(2):215-217.

[5] 骆 殊,邵 佳,沈 洪,等.黄芪莪术配伍抑制MKN-45裸鼠人原位胃癌模型肿瘤生长、转移及COX-2表达的增效研究[J].时珍国医国药,2012,23(5):1164-1165.

[6] 黄 黧,黄 黛,邢邯英,等. 复方中药牛黄天龙胶囊的体内抗肿瘤作用的机制[J].河北医药，2013,35(15)：2247-2249.

[7] 杨 洁,赵林涛,杨 瑞,等.扶脾化瘤饮抑瘤及延长生命的实验研究[J].陕西中医,2012,3(8):1092-1093.

(收稿：2017-03-15)

Effect of Fupi Hualiu decoction on subcutaneously implanted human gastric cancer in nude mice

Yang Jie，Yang Chengzu，Song Yanping，et al

Shannxi Academy of Traditional Chinese Medicine (Xi’an 710003 )

Objective: To investigate the effects of Fupi Hualiu decoction，a Chinese herbal formula，on tumor growth and the activity of TNF and NK． Methods: Forty BALB/C nude mice transplanted with SGC-7901 cells were randomly divided into five groups(8 mice per group)，and intragastric administered with normal saline or Fupi Hualiu decoction(20ml/kg)，or cyclophosphamide(20mg/kg) daily．Tumor volume were observed．Activity of TNF、NK were detected by L929 cell killing test． Results: Fupi Hualiu decoction of high and media groups had obvious inhibition to the tumor volume compared with controls,the tumor inhibition rate was 44.46%(P<0.01) and 35.79%(P<0.05).The production of TNF in mice bearing tumor was also enhanced significantly,Fupi Hualiu at the dose as above had cytotoxicity index of 55.53%、52.52%(P<0.01).The activity of NK cell could be increased by Fupi Hualiu at high dose,the killing ratio was 30.59%(P<0.05). Conclusion: Fupi Hualiu decoction has inhibitory effects on tumor growth in SGC-7901 gastric carcinoma，and has antagonism action to the immunosuppressive caused by tumor.

Stomach neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @Fupi Hualiu decoction Tumor necrosis factors Mice,nude

*陕西省科技攻关计划项目(2010K14-03-12)

胃肿瘤/中医药疗法 @扶脾化瘤饮 肿瘤坏死因子 小鼠,裸

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.08.074