CBX2-1与p53相互作用的机制①

刘婷隽

(徐州医科大学实验动物中心，江苏 徐州 221000)

CBX2-1与p53相互作用的机制①

刘婷隽

(徐州医科大学实验动物中心，江苏 徐州 221000)

目的：检测CBX2-1与p53是否存在相互作用，并一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。方法：在大肠杆菌中表达GST-CBX2-1融合蛋白，GST pull down纯化出蛋白与细胞裂解液混合，Western blot检测两个蛋白相互作用。同样的方法进一步检测CBX2-1与p53发生相互作用的结构域。结果：Western blot结果显示CBX2-1与p53存在直接相互作用，相互作用的结构域是CBX2-1蛋白N端1-288肽段和259-600肽段及p53蛋白的98-292肽段。结论：CBX2-1蛋白通过N端1-288肽段和259-600肽段与p53蛋白98-292肽段相互作用，为进一步研究研究CBX2-1参与神经性列腺癌的机制提供了一定的理论基础。

CBX2-1；p53；蛋白质相互作用

CBX2在发展性前列腺癌中最为潜在治疗目标发挥作用。研究发现，在转移型前列腺癌中CBX2的表达量持续增高，CBX2的高表达与较差的前列腺癌临床效果具有相关性。另外，在转移型前列腺癌的细胞株中，CBX2蛋白的缺失能够抑制细胞的存活，并诱发caspase3介导的细胞凋亡[1]。人类CBX2存在两个转录本，CBX2-1含有532个基因，CBX2-2含有211个基因[2]。前人的研究发现,CBX2-1比CBX2-2表达量更高，对CBX2-1的探究更深入，于是本实验选取CBX2-1作为研究对象。

新的研究表明[3]，在多种癌症中，CBX2基因量和mRNA的上调标志着肿瘤迁移和低存活率的发生。临床上，通过抑制CBX2的高表达作为药物治疗人类癌症的重要手段。此外，CBX2还参与细胞周期的调控。有文献报道，CBX2同源家族CBX8可以与p53协同作用调节结直肠癌中细胞的增殖[4]。而p53基因是目前发现的与人类肿瘤发病相关性最大的抑癌基因之一，其功能主要包括细胞周期停止(分化或衰老)、DNA复制与修复及细胞凋亡[5]。既然CBX2和p53都是参与肿瘤发生发展的重要蛋白，两者都可以调控细胞周期及细胞的分化，于是我们猜测CBX2-1是否与p53存在某种关系共同调节某些生命活动。而绝大多数蛋白都是通过与其他核酸或者蛋白发生相互作用来参与生物代谢过程的，那么CBX2-1与p53是否存在相互作用，成为本实验的切入点。

在本研究中我们发现，CBX2-1通过N端1-288肽段和259-600肽段两个结构域与p53蛋白98-292肽段相互作用。

1 材料方法

1.1 材料

30%聚丙烯酰胺、凝胶上样缓冲液、半干转转移缓冲液、Tris-Glycine电泳缓冲液、TBST、GST Resin 购于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP标记)购于上海Genetech公司、flag抗体、CBX2抗体购于上海Abmart公司、ECL plus购于美国GE公司。

1.2 重组蛋白在原核细胞中的大量表达

将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,37℃、250rpm振荡培养过夜。过夜的培养液以1:50转接于含100mL新鲜培养基的锥形瓶中，37℃、250rpm振荡培养1.5～2h，使OD值达0.4～0.6。加入IPTG(终浓度为0.5mM，37℃、250rpm条件下培养8h。

1.3 融合蛋白的纯化

诱导后的细菌在4℃、5000rpm条件下离心15min，用冰PBS洗一次，离心去上清。取沉淀菌体，向沉淀中加入8mlPBS和终浓度为1mM的PMSF，超声破碎大肠杆菌细胞，超声条件为：超10s，停10s，40%功率，15min。整个超声过程需在冰上进行，以防超声过程中蛋白质预热变性。

超声后，12000rpm，离心15min取上清，分别与Glutathione Resin beads孵育，4℃旋转过夜，次日，3000rpm，5min，离心收集珠子。用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗涤珠子，4℃旋转5min，共5次。离心收集珠子，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色检测纯化结果。

1.4 GST pull down检测蛋白质间相互作用

上述实验中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存；收集F293细胞，PBS缓冲液洗涤，加入细胞裂解液冰上裂解1h，4℃条件下12000r/min离心15min，取上清；将上清液与beads混合，4℃孵育过夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE电泳后WB检测相互作用结果。

上述实验中GST pull down后GST Sepharose beads 4℃留存，收集诱导表达His-Flag-CBX2的大肠杆菌，超声劈碎菌液细胞，PBS重悬后beads混合，4℃孵育过夜；用含有500mM Nacl，1%TritonX-100的PBS洗beads；SDS-PAGE电泳后WB检测相互作用结果。

1.5 Western Blot

细胞经一系列处理后经裂解液裂解，收取总蛋白(或收集beads，沸水煮沸5min，离心取上清)，等量的蛋白通过12%的SDS-PAGE胶进行跑胶分离，并转移至PVDF膜上；洗涤后，用5%脱脂奶粉封闭，并分别用GST(1:2000)、p53(1:1000)、Flag(1:2000)、CBX2-1(1:500)抗体孵育，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入HRP标记的羊抗鼠(1:2000)二抗室温孵育2h，TBST洗膜；ECL显色、发光。

2 结果

2.1 CBX2-1与p53存在相互作用

由于CBX2与p53的功能存在一定的相似处，两者都参与肿瘤的发展，并调控细胞分化与细胞周期。于是我们猜测CBX2-1与p53在空间上是否存在相互作用。我们纯化GST-CBX2-1蛋白，与F293细胞裂解液进行GST pull down，然后用p53抗体检测与CBX2-1相互作用。Western Blot结果表明，CBX2-1与p53存在相互作用(图1)。

图1 western blot检测P53与CBX2-1相互作用

2.2 CBX2-1与P53存在直接相互作用

图1的实验结果表明了CBX2-1与p53存在相互作用，但并不能确定两个蛋白之间是否可以存在直接相互作用，因此我们接下来通过原核表达的方法检测两个蛋白是否存在直接相互作用。我们首先通过PCR的方法将p53扩增出来，然后构建含有GST-标签的PGEX质粒载体中，转化至BL21中诱导表达。同时我们将CBX2-1构建到含有his-flag-标签的pcold-2载体中在BL21中诱导表达。随后通过GST-pull down亲和纯化GST-p53，纯化后的p53与超声的his-flag-CBX2-1菌液的超声上清液孵育进行GST-pulldown实验，用flag抗体进行检测，发现CBX2-1与p53存在直接相互作用(图2)。

图2 Western blot检测P53与CBX2-1存在直接相互作用

2.3 CBX2-1通过1-288和259-600两段与p53蛋白相互作用

既然CBX2-1蛋白与P53之间可以存在直接相互作用，那么CBX2-1蛋白通过哪个结构域与其相互作用成为我们感兴趣的问题。根据CBX2-1蛋白的结构与功能我们将其分成CBX2-1-1(1-288)、CBX2-1-2(259-600)、(601-1956)三段进行实验,分别构建进带有GST标签的pGEX载体中，然后诱导表达，通过GST-pull down纯化后，检测是哪一段domain与p53发生作用。首先收集2盘10cm板的F293细胞，加入1.6ml的lysis buffer冰上裂解1h后离心取上清，将上清与纯化出的GST-CBX2-1 3段蛋白混合过夜，用p53抗体进行检测，发现CBX2-1主要通过1-288和259-600两段与p53蛋白相互作用(图3)。

图3 Western blot检测CBX2-1与p53蛋白相互作用的domain

2.4 p53通过98-252肽段与CBX2-1蛋白相互作用

同样的，为了进一步研究p53蛋白与CBX2-1相互作用的结构域，我们根据p53蛋白的空间结构将其分为p53-1(1-97)，p53-2(98-292)，p53-3(293-393)三段进行实验，构建成带有GST标签的融合蛋白，随后GST pull down纯化后与F293细胞裂解液混合，检测是哪一段domain与CBX2发生作用。WB结果显示p53蛋白主要通过98-292肽段与CBX2-1相互作用。

图4 Western blot检测p53与CBX2-1蛋白相互作用的domain

3 讨论

多梳家族(PcG)蛋白可以作为组蛋白修饰激酶，通过调节染色质高级结构参与基因表达的调控。研究表明，PcG成员参与不同的细胞过程，例如干细胞分化、细胞命运决定、衰老、哺乳动物或肿瘤形成过程中调节X染色体的失活[6～8]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色质结构域，C端含有高度保守的Pc盒。在人类CBX2基因座上，含有两个转录体，一个转录体是由5个外显子组成含有532个基因的亚体CBX2-1，另一个转录体CBX2-2由4个外显子组成包含211个基因。

p53是重要的肿瘤抑制因子，p53基因编码的蛋白P53是一种转录因子，主要分布于细胞核浆，在正常情况下其功能就好似“基因卫士”，监测基因组的完整性，一旦发现损伤将激活一系列信号通路，包括细胞周期停滞、DNA修复、细胞凋亡，细胞衰老等[8，9]。

既然CBX2和p53都是参与肿瘤发生发展的重要蛋白，两者都可以调控细胞周期及细胞的分化，于是我们猜测CBX2-1是否也可以与p53共同作用调节某种生命活动。

首先运用GST pull down原理发现CBX2-1与p53存在相互作用，为了检测两者之间是否可以存在直接相互作用，我们尝试在大肠杆菌中分别诱导表达两个蛋白进行pull down实验。因此我们分别诱导表达了GST-P53和His-flag-CBX2进行pull down实验，结果证实两者之间可以存在直接相互作用。进一步分析两者之间的相互作用机制，我们发现CBX2-1主要通过1-288肽段和259-600肽段与p53相互作用，并且p53通过98-292肽段与CBX2-1相互作用。

但这种相互作用对于CBX2-1功能具有何种意义，CBX2-1是否能和p53协同作用共同调节结肠癌中细胞的的增殖，其是否与神经性前前列腺癌的发生发展有一定的关系，还需我们进一步证实。本文为研究CBX2-1参与神经性前列腺癌的机制提供了一定的理论基础。

[1]Clermont PL.Identification of the epigenetic reader CBX2 as a potential drug target in advanced prostate cancer[J]. Clin Epigenetics,2016,8:16

[2]Katoh-Fukui.Male-to-female sex reversal in M33 mutant mice[J]. Nature,1998,393(6686):688-692

[3]Clermont.Genotranscriptomic meta-analysis of the Polycomb gene CBX2 in human cancers: initial evidence of an oncogenic role[J]. Br J Cancer, 2014,111(8):1663-1672

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[5]Horn H.F. and K.H. Vousden, Coping with stress: multiple ways to activate p53[J]. Oncogene, 2007,26(9):1306-1316

[6]Kennison JA.The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: trans-regulators of homeotic gene function[J]. Annu Rev Genet, 1995,29:289-303

[7]Ringrose L. and R Paro. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins[J]. Annu Rev Genet, 2004,38:413-443

[8]Sparmann A and M van Lohuizen.Polycomb silencers control cell fate, development and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):846-856

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江苏省高校自然科学基金资助项目，编号：13KJD180003。

刘婷隽(1990～)女，江苏徐州人，硕士，助理实验师。

Q812

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1008-0104(2017)04-0084-02

2017-03-19)