不同提取方法对波棱瓜子多糖提取率的影响

刘美琳，董佳悦，安太勇，李杨，张梅

不同提取方法对波棱瓜子多糖提取率的影响

刘美琳，董佳悦，安太勇，李杨，张梅*

目的：考察用不同提取方法(回流提取法、超声波辅助提取法)对波棱瓜子多糖提取率的影响。方法：用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，在单因素实验的基础上，通过正交实验确定最佳提取工艺条件。结果：回流提取的最佳工艺条件为在100 ℃的水浴条件下，1：40(g：mL)的料液比，提取3 h，提取2次，多糖提取率为1.47%。超声波辅助提取的最佳工艺条件为在60 ℃水温条件下，以1：10(g：mL)的料液比，超声强度300 W、超声处理时间20 min，超声1次，多糖提取率为1.32%。结论：通过对两种方法最佳工艺的比较，回流法较超声法多糖提取率提高11%，回流法优于超声法，但差异无显著性。

波棱瓜子；多糖；正交实验；回流提取法；超声波辅助提取法

波棱瓜子系葫芦科波棱瓜属植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall. (H. pedunculosum(Ser.) Baill) 的干燥成熟种子，是一种常用藏药。具有清腑热，胆热的功效，用于治疗赤巴入脏腑，肝、胆热症(肝炎，胆囊炎)，消化不良等症[1]。波棱瓜子中主要含脂肪油、木脂素、多糖类等活性成分[2-4]。课题组前期研究表明，波棱瓜子多糖具有抗免疫性肝损伤作用。为进一步深入开展波棱瓜子多糖的研究，本文在前期实验基础上，参考相关文献[5-7]，对波棱瓜子多糖提取方法进行考察。分别采用热水回流提取法、超声波辅助提取法提取波棱瓜子中的多糖，比较波棱瓜子多糖的提取率，获得最佳的提取工艺条件。

1 材料

1.1 药材

波棱瓜子，2015年10月购于四川甘孜，经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定为葫芦科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall．的干燥成熟种子。

1.2 仪器

UV-2600型紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；BT 125D型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-600DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试剂

D-无水葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205)，浓硫酸、苯酚、正丁醇、三氯甲烷、无水乙醇、石油醚(60-90℃) 等均为分析纯；蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 回流法 波棱瓜子粉碎(过10目筛)，石油醚回流脱脂，滤渣按一定比例加入蒸馏水，水浴回流提取，减压浓缩，Savage法除蛋白，加入6倍体积的无水乙醇，醇沉过夜（静置24 h），滤过。取沉淀，精密称取25 mg，加蒸馏水溶解并定容至25 mL。精密吸取上述溶液4 mL，加蒸馏水定容至25 mL。

2.1.2 超声波辅助提取法 取波棱瓜子粉末，除提取方式为超声提取，其余同 “2.1.1”项下相同方法处理。

2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10 mg，加蒸馏水溶解制成0.1 mg/mL贮备液。分别准确吸取上述溶液5、10、15、20、25、30、35、40 mL于50 mL容量瓶中，定容。准确吸取2 mL置于10 mL具塞试管中，分别加入新制成5%的苯酚溶液0.2 mL，摇匀，迅速加入4 mL浓硫酸，充分摇匀，另取2 mL蒸馏水按同样显色条件作空白对照，置60 ℃水浴15 min，冰水浴冷却至室温。在400-600 nm内扫描，最大吸收波长为488 nm。在488 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖对照品溶液浓度(μg/mL)作为横坐标，相应的吸光度(A)作为纵坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0126 X+0.0014 (n=6，r=0.9995)。结果表明在10～80 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 波棱瓜子多糖含量测定 精密量取供试品溶液2 m L，置10 m L具塞刻度试管中，照标准曲线制备项下的方法测定吸光度，从回归方程中求出供试品溶液中葡萄糖的浓度，计算公式如下[8]：

（其中，V：样品溶液体积（ml）；C：多糖供试液中葡萄糖的浓度（μg/ml）；D：样品溶液的稀释倍数；m：称取样品的质量（mg））

2.3 正交实验

在单因素实验基础上，以料液比、时间、温度、提取次数等为考察因素，设计L9(34)正交实验来确定回流提取法(表1)、超声波辅助提取法(表2)提取波棱瓜子多糖的最佳提取工艺。

表1 回流提取法正交实验各因素水平表

表2 超声辅助提取法正交实验各因素水平表

2.4 结果与分析

2.4.1 回流提取法提取波棱瓜子多糖工艺的研究 根据单因素实验确定回流提取法提取波棱瓜子多糖的适宜条件为：料液比1∶60，提取时间2 h，提取温度100 ℃，提取次数固定为2次，在此基础上以提取率作为评价指标进行正交实验，结果见表3、表4。

由表3可知，影响波棱瓜子多糖提取的主要因素依次为：A＞C＞B，即提取温度＞料液比＞提取时间，由表4的进一步方差分析得知，提取温度对波棱瓜子多糖得率的影响最大，达显著水平。根据正交实验结果，波棱瓜子多糖多糖回流提取最佳方案为A3B2C1，即提取温度100 ℃，提取时间3 h，料液比1：40。在最佳工艺方案下回流提取多糖的提取率为1.48%。

表3 正交实验设计与结果分析

k2 1.0998 1.0660 0.9483 k3 1.3917 1.0204 1.0517 R 0.7701 0.0456 0.1091

表4方差分析表

2.4.2 超声波辅助提取法提取波棱瓜子多糖工艺的研究 根据单因素实验确定超声波辅助提取法提取波棱瓜子多糖的适宜条件为：固定超声功率300 w，料液比1：10，超声时间60 min，提取温度80 ℃，超声次数1次，在此基础上以提取率作为评价指标进行正交实验，结果见表5、表6。

表5 正交实验设计与结果分析

表6 方差分析表

由表5可知，各因素影响顺序依次为：C＞A＞B，即料液比＞超声温度＞超声时间，由表6的进一步方差分析得知，超声温度和料液比对波棱瓜子多糖提取有显著性影响。根据正交实验结果，波棱瓜子多糖超声提取最优方案是A1B1C1，即在60 ℃水温，超声功率300 W的条件下，以料液比1：10，超声提取20 min。在最优提取方案下超声提取多糖的提取率为1.39%。

2.4.3 验证实验

表7 不同方法提取波棱瓜子多糖的比较(n=3)

3 结论与讨论

本实验比较了2种不同方法提取波棱瓜子多糖，回流提取法所得工艺的最优组合是在100 ℃水浴条件下，以料液比1：40(g：mL)，提取时间3 h，提取2次，波棱瓜子多糖的平均提取率为 1.47 %。超声波辅助提取法的最优工艺参数为在60 ℃水温，300 w超声功率条件下，以1：10(g：mL)的料液比，提取1次，每次提取20 min，波棱瓜子多糖的平均提取率为 1.32 %，回流提取法提取率比超声法提取率高11%，但差异性不显著。

回流提取多糖成本较低，不需要特殊设备，但需较高温度，提取时间较长。而超声法提取多糖能源消耗少，提取时间短，操作简单，但超声波的机械剪切作用，可能导致多糖分子结构的改变。综上所述，不同的提取工艺各具优势，在今后的研究和生产中可根据实际情况选择合适的提取工艺。

[1] 杨永昌.藏药志[M].青海人民出版社.第一版,1991：441.

[2] 陈璐,张梅,李春沁,等. 波棱瓜子乙酸乙酯提取物对小鼠免疫性肝损伤的影响[J]. 中药药理与临床,2014,03：111-113.

[3] 陈璐,张梅,雷有成,等. 波棱瓜子脂肪油抗免疫性肝损伤的谱效关系研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2014,11：123-126.

[4] 李春沁,王紫燕,唐慧君,等. 波棱瓜子多糖对刀豆蛋白A所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床，2015,04：94-97.

[5] 程振玉,宋海燕,杨英杰,等. 不同提取方法对北五味子多糖提取率的影响[J]. 湖北农业科学,2015,01：159-163+167.

[6] 王广慧,戴明,魏雅冬. 香菇多糖的提取工艺研究[J]. 食品科技,2013,01：192-194.

[7] 王月囡,辛广,翁霞. 两种不同方法提取枸杞多糖的比较研究[J]. 鞍山师范学院学报,2010,04：39-43.

[8] 勾建刚,刘春红. 白茅根多糖超声提取的优化[J]. 时珍国医国药,2007,11：2749-2750.

Study on the effect of different extraction process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi/

LIU Mei-lin,DONG Jia-yue, AN Tai-yong, LI Yang, ZHANG Mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: The effect of various extraction (re fl ux extraction, ultrasonic assisted extraction) process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi was studied. Method: The content of polysaecharides were detected by phenol—sulfuirc acid colorimetrictitration method. The best extraction process was determined by orthogonal experiment based on the result of single factor experiment. Result: The best extraction process for reflux extraction method was to extract 2 times (3 h/times) with the ratio of material to liquid for 1：40 (g：mL) in 100 ℃water bath. The extraction rate of polysaccharide reached 1.47% under the best condition. The best process for the ultrasonic assisted extraction method was to extract 1 times (20 min/times) with the ratio of material to liquid for 1：10 (g：mL) in 60℃ water bath, ultrasonic power 300 W. And the extraction rate of polysaccharide reached 1.32% under the best condition. Conclusion: The re fl ux extraction yield increase nearly 11% compared with that of ultrasonic assisted extraction. However, there is no significant difference between the two extraction methods in extraction efficiency of Bolengguazi polysaccharide .

Bolengguazi; polysaccharide; orthogonal test; re fl ux extraction；ultrasonic assisted extraction

R 283.6

A

1674-926X(2017)04-008-03

四川省科技支撑项目(2013SZ0114)

成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地 四川 成都 611137

刘美琳，中药学专业在读硕士Tel：18782984265 Email：674894419@qq.com

张梅，教授，博士生导师Tel：028-61800231 Email： zhangmei63@126.com

2017-1-15

(责任编辑：傅舒)