桂郁金对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

张技，蒋淼，李白雪

桂郁金对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

张技1，蒋淼2，李白雪1

目的：探讨桂郁金对肝纤维化的作用机制。方法：用血小板衍生生长因子（PDGF）诱导肝星状细胞HSC-T6活化，随后采用桂郁金醇提取物进行干预；采用ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量，采用半定量RT-PCR法检测细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达水平。结果：与空白组相比，模型组中上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量明显增高（P＜0.01），TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达均呈现显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，桂郁金醇提取物低浓度组、高浓度组上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量均有所下降（P＜0.05），TGF-β1 mRNA的表达水平存在差异（P＜0.05），Smad3 mRNA的表达水平在高浓度组中存在差异（P＜0.05）。结论：桂郁金可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通络，起到抗肝纤维化的作用。

桂郁金；肝纤维化；转化生长因子-β1；Smad

肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是肝细胞受到炎症刺激或坏死时，肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）被激活，进而增殖，合成并分泌大量的细胞外基质（extra cellular matrix, ECM），导致ECM沉积增多，形成肝纤维化。祖国传统医学并无肝纤维化的记载，现代医家根据其临床症状，将肝纤维化归于“积聚”、“胁痛”、“肝着”等病症的范畴。目前，在临床上，尚未开发出针对肝纤维化有效治疗的西药。已有研究显示，桂郁金对改善肝功能、抗肝纤维化有显著疗效，但其作用机制有待进一步研究[1～2]。本研究利用血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）诱导肝星状细胞HSC-T6活化，随后采用桂郁金醇提取物进行干预，旨在研究桂郁金对转化生长因子β1（transforming growth factor - β1, TGF-β1）及其下游信号转导分子Smads表达水平的影响，以探讨桂郁金抗肝纤维化的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株

本实验采用肝星状细胞株HSC-T6，购自四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室

1.2 药物、试剂与仪器

桂郁金（购自广西钦州陆屋镇）；新生小牛血清（兰州民海生物有限公司），DMEM培养基（Gihco，Grand Island，NY，美国），Ⅰ型、Ⅲ型胶原试剂盒（上海森熊科技实业有限公司），TRIZOL Reagent试剂（Inicitrogen，CA），逆转录试剂盒（EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix，北京全式金生物技术有限公司），PCR试剂盒（Fermentas）；Powerwave XS型全波长扫描酶标仪（Bio-tek，美国），PCR仪（Bio-radiCycler，美国）

2 方法

2.1 实验分组

实验设定4组，分别为空白组、模型组、桂郁金醇提取物低浓度组、桂郁金醇提取物高浓度组。将HSC-T6接种于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养。取对数生长期的HSC-T6细胞以1.0×105个/孔的密度接种于96孔板，在37℃、5% CO2的条件下，培养过夜。分别在模型组、桂郁金醇提取物低浓度组、高浓度组加入血小板衍生生长因子PDGF (终浓度5 μg﹒L-1)，30 min后，在低、高浓度组分别加入桂郁金醇提取物(终浓度22.5 μmol﹒L-1、90 μmol﹒L-1)，分别培养48 h。

2.2 HSC-T6上清液中胶原的含量的检测

HSC-T6细胞分组培养48 h后，收集上清液，用ELISA测定上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量。

2.3 半定量RT-PCR检测HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达水平

H S C-T 6细胞分组培养4 8 h后，采用TRIzol法抽提总RNA。TGF-β1 上游引物：5’-TGGAGTTGTCCGGCAGTGGC-3’，下游引物：5’-TGCTGTACTGTGTGTCCAGG-3’；Smad2上游引物：5’-TACCCACTCCATTCCA-3’，下游引物：5’-TGATAAACGGAATCAA -3'；Smad3上游引物：5'-TTCCAGAAACCCCACCT-3'，下游引物：5'-GACAGCCTCAAA-GCCCT-3'；内源性参照引物β-a c t i o n R a c t i n 2 2 9 S：5’-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3’，Ractin229AS：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’

2.4 统计学处理

数据分析采用SPSS 17.0，数据用表示，组间采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HSC-T6上清液中胶原含量

与空白组相比，模型组中上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量明显增高；与模型组相比，桂郁金醇提取物干预48 h后，低浓度组、高浓度组上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量均有所下降，具体结果见表1。

表1 各组HSC-T6上清液中胶原含量的比较

3.2 HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达水平

与空白组相比，模型组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达均呈现显著增高；与模型组相比，桂郁金醇提取物低浓度组、高浓度组中TGF-β1 mRNA的表达水平存在差异，Smad2 mRNA的表达水平差异不明显，Smad3 mRNA的表达水平在低浓度组中差异不明显，在高浓度组中存在差异，具体结果见表2。

表2 各组HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平的比较

4 讨论

HSC的活化增殖是肝纤维化发生的中心环节。活化的HSC 转化为肌成纤维细胞，合成大量ECM，导致ECM合成和降解失衡，促进了肝纤维化的发生[3～4]。因此，抑制HSC的活化增殖或促进活化的HSC凋亡是防治肝纤维化的重要手段。TGF-β是一类能够调节细胞生长和分化的多肽，具备多种生物作用，在肝纤维化发生发展过程中具有活化HSC，促进胶原基因表达，促进ECM合成与沉积等作用，是最重要的促肝纤维化细胞因子之一[5～6]。Smads蛋白是TGF-β受体复合物下游起重要作用的信号分子， TGF-β通过与Smad2、3等结合，使其发生磷酸化，随后引起靶基因的转录，Ⅰ型胶原等细胞外基质大量合成，进而促进肝纤维化[7]。

HSC激活增生转化是肝纤维化的中心环节，TGF-β是这一病理过程中必需的生物调节因子，Smads 又是TGFβ唯一的作用底物，故TGFβ- Smads信号通路对HSC产生的影响引起极大关注[8～9]。TGFβ-Smad信号转导通路在肝纤维化发病中起着举足轻重的作用，干预该信号通路就成为肝纤维化防治的理想选择[10]。

研究结果显示，HSC-T6在PDGF作用48 h后，引起了TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达水平的显著上调，同时在培养细胞上清液的检测中，发现Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量显著升高，提示PDGF通过TGF-β1/Smad通路使肝星状细胞活化，促进HSC-T6分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原。同时，HSC-T6在PDGF作用30 min后，采用桂郁金醇提取物干预后发现，TGF-β1 mRNA的表达水平存在差异，且呈现出随剂量的增长差异更显著，Smad3 mRNA的表达水平在低浓度组中差异不明显，在高浓度组中存在差异，Smad2 mRNA的表达水平差异不明显；在培养细胞上清液的检测中，发现Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量均有所下降，且随干预药物剂量的升高而降低。结果提示，桂郁金醇提取物可能通过TGF-β1/Smad通路，抑制HSC-T6的活化、增殖，进而起到抗肝纤维化的作用。

本研究虽然起到了相关的提示作用，但在TGF-β1/Smad通路中，有着大量信号因子，本实验仅检测了相关的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达情况，数据不够全面。此外，在基因表达过程中，还会受到许多因素的调控，本实验中还未涉及到相关蛋白表达的测定，及调控因素的检测，这些都是在以后的实验中可进一步完善。

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Effects and mechanism of Guangxi Yujin on TGF -β1/Smad signaling pathways in HSC-T6

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ZHANG Ji1, JIANG Miao2,LI Bai-xue1//(1. School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, Sichuan; 2.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, Sichuan)

Objective: To investigate the protective effects and mechanism of Guangxi Yujin on hepatic fibrosis. Method:HSC-T6 was activated by platelet-derived growth factor(PDGF), and then treated by alcohol extracts of Guangxi Yujin. The ELISA method was adopted to detect the contents of collagen Ⅰand Ⅲ in supernatant of hepatic stellate cell (HSC-T6). mRNA expressions of transforming growth factor (TGF)- β1, Smad2, Smad3 were measured by semiquantitative RT-PCR. Result: The contents of collagen Ⅰand Ⅲ in supernatant of HSC-T6, and the expressions of TGF- β1, Smad2, Smad3 mRNA in HSC-T6 were markedly higher (P＜0.01) in the model group than those in the blank group. Compared with the model group, the contents of collagen Ⅰand Ⅲin supernatant of HSC-T6 ,and the expression of TGF- β1 in HSC-T6 were lower (P＜0.05) in alcohol extracts of Guangxi Yujin group.Conclusion: Guangxi Yujin probably plays a role of anti-hepatic fi brosis by inhibiting TGF -β1/Smad signaling pathway.

Guangxi Yujin; hepatic fi brosis; transforming growth factor (TGF)- β1; Smad

R 285.5

A

1674-926X(2017)04-009-03

成都中医药大学校基金(NO. 030018031)

1.成都中医药大学 基础医学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137

张技，女，博士研究生，主要从事中医证候的分子生物学研究Tel：13880552842 Email：27629565@qq.com

2017-02-19

（责任编辑：陈思敏）