基于SIRTs/NF-κB信号通路探讨中医药调控及其对慢性肾脏病的治疗机制❋

魏明刚，何伟明，熊佩华，孙 伟△

(1.苏州大学附属第一医院中西医结合科,苏州 215006； 2. 江苏省中医院肾科,南京 210029)

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)已经成为世界范围内危害公众健康的常见病和多发病，CKD随着病情进展则肾功能逐渐减退并最终发展成为终末期肾病(end stage of renal disease, ESRD)，而需要血液净化或器官移植等维持生命，对社会和家庭造成极大影响[1]，寻找有效的治疗手段并阐明其作用机制对于大众健康和社会发展至关重要。

1 慢性肾脏病发病机制的概述

对于CKD而言，导致病情不断加重成为ESRD的直接原因是肾脏纤维化，肾脏纤维化的核心是肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)[2]。RIF 病变中肾小管上皮细胞转分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)代谢失调是其主要原因[3-4]。EMT表现为上皮细胞转分化为肌成纤维细胞导致组织纤维化，而肌成纤维细胞具有合成和促进ECM的积聚，ECM积聚会进一步加重EMT的程度。也就是说，EMT与ECM代谢失调两者之间相互影响产生恶性循环导致肾脏纤维化，肾功能逐渐丧失成为ESRD。非感染性炎症、氧化应激和衰老等是影响CKD产生RIF的重要因素[5-6]。研究表明，调控某些功能蛋白可以一定程度上减轻RIF，延缓CKD病变进展[7-10]。

肾间质是肾小管之间、肾血管以外的肾脏实质性组织，由细胞及ECM组成。细胞主要是间质细胞。ECM主要包括胶原(collagen, COL)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)等五大类，COL是最主要的成分。众所周知，ECM在肾小球及肾间质过度堆积是肾脏纤维化的主要原因，而EMT与ECM的代谢相互促进。因此，EMT和ECM代谢调控是治疗的关键问题。对于EMT的调控而言，转化生长因子-β(transforming growth factor, TGF-β)是最重要的上游细胞因子，smads是其最主要的下游效应物质，smads信号传导是TGF-β1诱导EMT的关键通路[11]。对于肾小球而言，TGF-β1也是公认导致其纤维化病变发生的上游细胞因子。也就是说，TGF-β/Smads细胞信号通路是纤维化病变时影响病变发生发展的主要细胞信号通路[12]。ECM降解酶系中基质金属蛋白酶系(matrix metalloproteina seseries，MMPs)对ECM有广泛的降解作用，MMPs是调节ECM代谢平衡最重要的酶系[13]。金属蛋白酶调控因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，其中TIMP-1能够抑制所有已知的MMPs活性，从而维持生理状况下ECM沉积和降解平衡。肾脏纤维化时ECM中富含COLIV，MMP-9是COLIV的特异性降解酶，TIMP-l不仅可与活化的MMP-9结合阻断其活性，亦可与MMP-9前酶结合阻止其活化，从而导致COLIV在肾脏过度增加而加快肾脏纤维化过程。ECM异常的积聚导致正常组织结构破坏，这种病理现象在肾小球和肾小管间质均存在，肾小球硬化和肾小管间质纤维化导致肾功能丧失[14]。因此，RIF是各种肾小球和肾小管间质疾病的最后结局，是导致ESRD的共同通路。也就是说，ECM调控是延缓甚至逆转CKD病情发展的核心问题。本研究应用“芪归益肾方”(qiguiyishen, QGYS)调控ECM代谢的研究发现，方剂及其组分对于ECM代谢的调控作用确切[15]。但这仅仅是研究中发现的现象，其病变机制尚需进行深入探讨才能揭示其本质。

2 SIRTs/NF-κB信号通路在慢性肾脏病中的作用

2.1 NF-κB与慢性肾脏病

NF-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)是从成熟的B淋巴细胞中提取，因其能与κ轻链基因增强子的κB序列(5-GGG ACT TTC C-3)特异性结合，并促进κ轻链基因蛋白的表达，故称之为核因子κB (NF-κB)[16]。NF-κB家族有5位成员NF-κB1(p50)、NF-κB 2(p52)和RelA(p65)等。它们的N末端均由约300个氨基酸组成的Rel同源区(Rel homology domai-n, RHD) ，故而又称之为NF-κB/Rel蛋白家族。RHD有发生二聚化和结合DNA等功能。NF-κB/Rel蛋白家族多以同源或异源二聚体的形式存在，不同的NF-κB/Rel蛋白二聚体具有不同的结合序列和功能。NF-κB最常见p50/p65二聚体，NF-κB 广泛存在于细胞中并调节细胞因子、黏附因子和免疫受体基因等表达，从而影响细胞的分化、炎症反应和凋亡等[17-18]。TGF-β与上述功能关系密切，而且是公认引起CKD纤维化的主要细胞因子[19-20]。TGF-β直接作用于其下游效应物质smads，进而影响EMT过程和ECM代谢。也就是说，NF-κB通过影响TGF-β/smads信号通路，从而影响肾脏组织纤维化相关的过程和ECM代谢[21]。另外，TGF-β激活激酶1(transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1)参与了NF-κB上游的免疫复合物激活，而TAK1也可以被TGF-β1激活。这种相互作用导致纤维化持续恶化最终引起肾功能丧失[22]。静息状态下NF-κB与其抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB, IκB)以非活性的形式存在于胞浆中，细胞的衰老、炎症或氧化应激等条件下IκB激酶 (IκB kinase，IKK)被激活，从而使IκB经快速磷酸化和泛素化后降解，并暴露出 NF-κB的核定位序列，NF-κB发生核移位并与特定的κB序列结合后引起相应靶基因的转录激活。Ricardo等[23]发现，尽管NF-κB不能控制TGF-β1的基因启动因子，但NF-κB能调节谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase, TGase)的启动和转录，而在组织中此酶是TGF-β1的激活剂。组织中TGase与基质蛋白交联，模型动物如果增加此酶的表达不但能加重肾脏纤维化[24]，而且间接诱导 TGF-β1表达增强，从而加重肾脏EMT和ECM聚集。因此，NF-κB与TGF-β1的联系一定程度上通过调控smads、TAK1和Tgase的表达实现。NF-κB通过TGF-β/smads和TGF-β/TGase信号通路或者受到TGF-β1逆向调控，进而借助TAK1正反馈作用促进肾脏纤维化病变的进展。上述途径为通过调控NF-κB及TGF-β1表达作用，为达到延缓肾脏纤维化提供了重要的理论支撑。此外，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 (Serine/threonine protein kinase, Akt)是磷脂酰肌醇-3 激酶 (phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3K) 的一个下游靶点。Akt可通过增强IκB的磷酸化减少IκB蛋白合成而激活NF-κB，提示Akt的异常激活在此过程中发挥着重要作用[25]。

2.2 Sirtuins对NF-κB的调控

沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)的相关酶(Sir2-related enzymes，sirtuins)，是近年来在酵母中发现的一类依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的组蛋白去乙酰化酶。Sirtuins从单个细菌到人类组织广泛分布，是一种高度保守性的蛋白。目前人类发现的sirtuin家族成员有7个，分别命名为SIRT1-7,其中SIRT1是与酵母染色质Sir2同源性最高的一个。SIRT1存在于包括人类在内的多种生物体体内，其通过对组蛋白和多种非组蛋白赖氨酸残基去乙酰化修饰作用干预基因表达，参与细胞衰老、炎症和免疫调节等生命活动[26]。研究发现，SIRT1参与上述生命活动过程并对机体的影响作用与调控NF-κB的活性密切相关[27-28]。静息细胞中NF-κB抑制蛋白IκB与NF-κB的P65亚基结合，使NF-κB处于功能失活状态。细胞在受到刺激后如炎症因子、活性氧等作用时IκB发生磷酸化被降解，NF-κB恢复活性并通过核膜上的受体进入细胞核与靶基因启动子相结合，迅速诱导靶基因的转录，从而影响机体的生命活动[29-30]。SIRT1可将NF-κB的P65亚基第310位的赖氨酸去乙酰化抑制NF-κB，从而减轻炎症因子和活性氧诱导的炎症反应[31-32]。SIRT1与细胞凋亡蛋白1抑制子(cellular inhibitor of apoptosis protein-1, cIAP) 基因启动子的结合，同样可导致该区域组蛋白去乙酰化, 使其不再被NF-κB激活，从而达到减轻细胞凋亡的作用[33]。而且，SIRT1阴性表达的巨噬细胞中NF-κB高度乙酰化，导致多种炎性因子表达，从另一个侧面说明SIRT1与NF-κB之间的密切联系[34]。

另一方面，SIRT1可调控机体和组织内MMPs和TIMPs的表达[35-36]，而MMPs 和TIMPs 正是与组织纤维化密切相关的ECM代谢最为关键的酶系。非感染性炎症时NF-κB与TGF-β1在组织中异常表达，从而导致纤维化进展。SIRT1能抑制脂肪酸介导的非感染性炎症以及炎症相关细胞因子的表达[37]。用SIRT1激活剂resveratrol处理的细胞可以增加SIRT1与cIAP的结合，最终的效应是使其不再被NF-κB激活，从而减轻炎症因子等导致组织纤维化的程度，保护组织器官功能正常[38]。

此外，SIRT1可以直接作用于组蛋白H4K16、H3K9和H1K26等使赖氨酸去乙酰化，从而促进染色质的静默而抑制其转录活性。去乙酰化作用导致组蛋白乙酰化程度降低，而组蛋白乙酰化与甲基化过程又常常相互转化，因此SIRT1去乙酰化作用导致甲基化作用改变，从而降低组蛋白H3K9的甲基化程度。组蛋白H3K9甲基化是基因转录沉默的标志[39]。SIRT1作用于H3K9甲基化催化酶所在的区域，从而影响组蛋白H3K9的甲基化，进而抑制相关基因转录达到影响NF-κB细胞信号的激活[40]。因此上述研究不但从多个角度证实，SIRT1通过抑制NF-κB的活性达到调控NF-κB介导的纤维化相关效应，而且也证实SIRT1可以调控ECM代谢。提示基于SIRT1进而调控NF-κB表达，从而达到延缓纤维化病变进程是可行的。

2.3 中医药对SIRTs/NF-κB信号通路的调控作用

本研究发现，QGYS延缓肾脏纤维化的作用与PI3K/Akt密切相关。QGYS及黄芪等药物干预可以显著下调TGF-β1在UUO小鼠肾组织上的表达水平。QGYS和黄芪单味药均可以减轻UUO小鼠肾小管病变。研究表明，NF-κB及IκB在QGYS和黄芪单药的肾组织中低表达，2组效果均优于西药洛丁新，且QGYS优于黄芪单药，体现了中医复方中药物相互配合、作用全面的特点及优势。QGYS可以缓解UUO小鼠肾脏EMT的程度，减轻ECM异常积聚，从而延缓肾脏纤维化进展，从分子生物学角度验证了该结论的可靠性。课题组在另一个研究证实，QGYS可以明显抑制阿霉素肾病大鼠肾脏纤维化的病变过程，其作用机制同样是多靶点作用，疗效与减少尿蛋白漏出，降低尿NAG酶水平，抑制肾脏ECM积聚，改变TGF-β1、TIMP-1和MMP-2在肾脏皮质的表达，从而有利于降解ECM。进一步研究发现，这些作用的实质与NF-κB/TGF-β1/Smad调控密切相关，因此QGYS基于NF-κB对ECM的调控具有其合理性[41-42]。结合SIRTs与NF-κB之间的密切关系，特别是SIRT1等对于NF-κB的调控作用，在研究中进一步证实两者之间关系密切，相关体内外实验研究工作已基本完成，论文尚未发表。

综上， NF-κB在CKD病变过程被激活并受各种因素影响下作用增强，激活的NF-κB与TGF-β/smads等细胞信号协同作用影响肾脏纤维化的进程[43]。借助表观遗传学研究认识到，通过SIRTs蛋白的调控可以影响NF-κB表达，进而影响TGF-β/smads等细胞信号通路相关基因表达作用，为探讨肾脏纤维化病变关键靶点提供了方向。因此，通过调节SIRT1的表达进而影响NF-κB和TGF-β/smads等信号通路相关细胞因子表达、基因转录、基因翻译和细胞周期蛋白表达，从而减轻肾脏纤维化[9]的研究思路具有可行性。

3 中医学对慢性肾脏病的认识

从中医学角度探讨CKD病变的始动因素是肾气亏虚，病机关键则是脾肾两虚和血脉瘀阻。人体脏腑功能正常、气血充盈流畅则外邪难以入侵，内邪难以产生，就不会发生疾病。故《素问遗篇·刺法论》说：“正气存内，邪不可干。”而当人体脏腑功能失调、正气相对虚弱、卫外不固，或人体阴阳失衡、病邪内生，均可使人体脏腑组织经络官窍功能紊乱从而发生疾病。《素问·评热病论》说：“邪之所凑，其气必虚。”《灵枢·口问》说：“故邪之所在，皆为不足。”《灵枢·百病始生》也说：“此必因虚邪之风，与其身形，两虛相得，乃客其形。”《素问·生气通天论》所谓“阴平阳秘，精神乃治”就是指人体阴阳动态平衡为关键，而CKD正是阴阳失调为病。肾中阴精是一身精气血化生的源泉，肾中阳气是功能活动的原动力。肾中阳气是元气所化生，是生命活动的根本。CKD多表现为肾中阳气受损，肾脏不能发挥气化温煦作用，轻则水液代谢异常，重则水毒伤及脏腑引起变证百出而危及生命。正如《素问·逆调论》所论“肾者水脏，主津液”“诸病水液，澄沏清冷，皆属于寒”和“诸寒收引，皆属于肾”的观点。CKD发展到一定程度往往伴有血脉瘀阻的证候，也就是说，一方面不能闭藏精气，脾肾俱虚导致精气外泄；另一方面气血失和导致气不帅血则血脉运行不利。血脉运行不利则引起脉络闭阻而致病变深入，所以血脉瘀阻往往贯穿于CKD始终。

从中医学角度而言，正气亏虚必将导致血液失去动力而瘀阻，血脉瘀阻也会导致脏腑功能失常影响正气生成，两者相互影响。从现代医学而言，肾小球本身血脉丰富且细小，易于受到各种病因作用导致血脉瘀阻和肾小球功能下降，以致肾脏功能损伤进行性加重。因此从中医学角度而言，“正气亏虚”和“血脉瘀阻”是CKD发病的核心病因。从现代医学而言，肾脏纤维化导致CKD病变进展是其核心病理。应用中医药治疗CKD的主要目的就是应对“正气亏虚”和“血脉瘀阻”，达到阻止CKD病变进展的作用。前一章节的论述证实，SIRTs和NF-κB水平与肾脏纤维化密切相关，因此对于SIRTs和NF-κB调控必将对于CKD的防治起到重要作用。中药及其活性成分可以有效地调控SIRTs家族在体内的表达水平，进而调控NF-κB表达，从而达到调控ECM在组织间的积聚，发挥肾脏的保护作用[7]。

中医药对慢性肾病的治疗是通过SIRTs/NF-κB信号通路的调控影响而发挥作用，主要是通过对SIRTs和NF-κB水平的调控，影响肾脏纤维化相关的细胞因子TGF-β和细胞外基质相关的代谢酶，从而达到延缓肾脏纤维化达到治疗CKD的目的。中医药对于SIRTs和NF-κB的调控发挥作用，不仅仅是由于中医药对相关细胞信号通路关键细胞因子的调控作用，同时也是对CKD多个重要分子生物学病变机制的多靶点治疗作用，体现了中医药研究从宏观到微观、从整体到局部、从干预到改变的认识方法和治疗思路。

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