QuEChERS净化－高效液相色谱－串联质谱法测定蜂蜜中农药及抗生素的含量

苗琼晨，聂 晶，吴慧珍，钱鸣蓉，孙彩霞，李祖光＊

（1．浙江工业大学 化学工程学院，杭州310014； 2．浙江省农业科学院 质量标准研究所，杭州310021）

蜂蜜作为人们日渐喜爱的养生产品越来越受欢迎，但由于养蜂过程中，蜂农为了防止蜜蜂患上腐臭病、白血病等细菌性疾病，会使用大量抗生素来防治，这可能会导致蜂蜜抗生素残留超标而影响蜂蜜质量［1－3］，给食用者带来不同程度的身体损害［4－6］；蜜蜂在采蜜过程中可能会采集到被农药污染的蜜源，造成蜂产品中出现农药残留。三唑类农药作为一代新的杀菌剂，广泛应用于粮食作物、蔬菜和水果中［7］，由于其亲脂性的特性，其积聚在各种生物组织以及在生态系统中进行传输而会对食物链造成污染［8］。目前，针对蜂产品中农药残留检测的主要对象是有机磷杀虫剂和拟除虫菊酯类农药，尚未制定三唑类农药在蜂产品中的限量标准，因此建立对蜂蜜中抗生素及三唑类农药残留的监测对保证蜂蜜产品的安全具有十分重要的现实意义。

QuEChERS方法是一种快速高效的前处理分析方法，QuEChERS方法应用在蜂蜜中农药及兽药残留检测方面已有文献［9－15］报道。本工作在传统QuEChERS方法的净化步骤上进行了改进，利用带磁性的净化吸附剂来除杂，免去离心的步骤，加快了蜂蜜样品的净化处理过程，并且磁性净化剂还可以回收利用，符合绿色环保的要求。本工作对各个影响因素进行了优化，在优化条件下采用高效液相色谱－串联质谱法对蜂蜜中15种三唑类农药及15种抗生素（包括2种四环素类，4种大环内酯类和9种喹诺酮类）残留进行测定，可为蜂产品中30种农药和抗生素的快速筛选提供科学的分析检测技术。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Thermo TSQ Quantum型液相色谱－串联质谱仪，配Survey液相操作系统；AL 204型电子分析天平；KQ－50E型超声波清洗器。

混合标准溶液：称取15种三唑类农药包括联苯三唑醇、糠菌唑、苯醚甲环唑、氟环唑、腈苯唑、三氟苯唑、氟喹唑、氟硅唑、己唑醇、腈菌唑、多效唑、戊菌唑、戊唑醇、三唑酮和灭菌唑，15种抗生素包括2种四环素类（金霉素、四环素），4种大环内酯类（交沙霉素、罗红霉素、替米考星和泰乐菌素）和9种喹诺酮类（氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、奥比沙星、恩诺沙星、双氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星）等标准品适量，用甲醇溶解，分别配制成100．0mg·L－1的标准储备溶液，于－4℃避光保存。使用时用甲醇稀释至5．00mg·L－1，配成混合标准溶液，于－4℃避光保存。

Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液：将0．1mol·L－1柠檬酸溶液1L与0．2mol·L－1磷酸氢二钠溶液625mL混合，再用氢氧化钠溶液调节pH至4．0，称取乙二胺四乙酸二钠60．5g放入上述混合溶液中，使其溶解，摇匀。

氯化钠、乙酸钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠均为分析纯；乙腈、甲醇、乙酸乙酯均为色谱级；试验用水为去离子水。

1．2 仪器工作条件

1）色谱条件 Luna C18色谱柱（150mm×2．00mm，3μm），柱温30 ℃；进样量5μL；流量0．2mL·min－1；流动相 A 为0．1%（体积分数，下同）甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0．0～0．1min时，B为80%，保持5min；5．0～12．0min时，B由80%降至10%；12．0～18．0min时，B由10%升至80%。

2）质谱条件 电喷雾正离子源（ESI＋），毛细管温度350℃；喷雾电压4 000V；鞘气流量0．7L·h－1；辅助气 流 量 0．2L·h－1；碰 撞 气 为氩气（0．2Pa）；多反应监测（MRM）模式。

30种化合物的其他质谱参数见表1，其中“＊”为定量离子。

表1 质谱参数Tab．1 MS parameters

表1（续）

1．3 试验方法

称取蜂蜜样品1．000 0g于50mL离心管中，加入 pH 4．0 的 Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液6mL，涡旋30s，再加入乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液18mL继续涡旋30s，之后依次加入氯化钠2g，无水硫酸钠4g，快速摇匀，振荡2min后，以7 000r·min－1转速离心5min后静置。取上清液6mL转移至已加入磁性C18和N－丙基乙二胺（PSA）各20mg的20mL样品瓶中，振荡30s后，使用外部磁力将固液两相进行分离，将液体倒入10mL玻璃管内经氮气吹干后，用1mL初始流动相0．1%甲酸溶液－乙腈（2＋8）混合液复溶后，过0．22μm膜，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

50μg·kg－1的30种农药及抗生素的色谱图见图1。

2．2 盐析条件的选择

2．2．1 缓冲溶液及其酸度

蜂蜜中含糖量较高，对样品前处理造成干扰，因此，为了缓解蜂蜜样品黏稠状态，需要加入适当的溶液来稀释样品，从而有利于化合物的提取［16］。试验选择较为常用的水溶液和Mcllvaine缓冲溶液来稀释样品。结果表明：在Mcllvaine缓冲液稀释作用下，提取效率明显提高，同时考虑到提取目标物中含有能和金属离子产生螯合作用的四环素类抗生素，试验选择Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液为蜂蜜样品的稀释溶液。

考虑到目标物大都属于两性化合物，试验还考察了不同 酸 度 （pH 分 别为 3，4，5，6，7，8）的Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液对提取效率的影响［15］，见图2。

图1 15种三唑类药物（1～15）和15种抗生素（16～30）的色谱图Fig．1 Chromatograms of 15triazoles（1－15）and 15antibiotics（16－30）

由图2可知：农药和抗生素的回收率随缓冲溶液酸度增大基本呈现先升后降的趋势，其中三唑类农药和四环素类抗生素表现较为明显，各类药物在Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液pH为4时均出现了较为理想的回收率。蜂蜜样品的pH控制在3．2～4．5之间时，加入缓冲盐可以保持蜂蜜样品的酸碱稳定性，试验选择Na2EDTA－Mcllvaine缓冲溶液的酸度为pH 4．0。

2．2．2 提取剂

图2 缓冲溶液的酸度对提取回收率的影响Fig．2 Effect of acidity of buffer solution on extraction recovery

在QuEChERS方法对抗生素的提取试验中发现，乙腈为提取剂时，蛋白质等共提物比较少，且乙腈比丙酮、甲醇更易与水分离［17］；试验还考察了乙腈、甲醇、丙酮等溶剂对三唑类农药的提取效率，结果表明乙腈对三唑类农药的提取效率较高。试验进一步发现在乙腈溶液中加入5%（体积分数）乙酸溶液，农药和抗生素的回收率均较高，试验选择乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液作为提取剂。

2．2．3 盐析剂和吸水剂

QuEChERS方法常用的盐析剂有乙酸钠、氯化钠，常用的吸水剂有无水硫酸镁、无水硫酸钠。考虑到硫酸镁中的Mg2＋和四环素类药物可能会结合生成螯合物，从而影响四环素类药物的提取，而乙酸钠水解作用下会影响缓冲体系的酸度，试验选择氯化钠为盐析剂，无水硫酸钠为吸水剂。

2．3 净化条件的选择

2．3．1 除杂吸附剂

在QuEChERS方法中，较为常用的除杂吸附剂主要有C18和PSA，C18可除去脂类等非极性物质，PSA可除去极性有机酸、脂肪酸、糖类等物质。传统的净化过程是加入不带磁性的C18和PSA来除杂吸附，再离心分离，所需净化剂量较大，且离心分离需要较长时间。试验分别考察了无磁性C18和PSA、磁性C18和PSA对试验过程的影响。结果表明：使用无磁性C18和PSA时，传统离心步骤以及吸取上清液转移至少需要10min；磁性吸附剂只需要1min即可完成吸附杂质和倾倒提取液2步，其主要依靠外部磁场来完成，方便快捷。试验选择使用磁性C18和PSA来进行除杂吸附。

2．3．2 磁性C18和PSA用量

试验考察了磁性C18和PSA用量（二者分别加入10，20，30，40，50mg）对各类药物回收率的影响，其结果见表2。

表2 吸附剂用量对回收率的影响Tab．2 Effect of the amounts of adsorbent on recovery

由表2可知：在磁性C18和PSA加入量分别为20mg时，药物回收率达到最高；增加磁性C18和PSA的用量，药物回收率呈下降趋势，这可能是由于加入的吸附剂量过大，磁性吸附剂对目标物有一定吸附及包裹，使药物在分离过程中被保留而降低其回收率。试验选择磁性C18和PSA的用量分别为20mg。

用过的磁性C18和PSA经丙酮、甲醇清洗后可重复使用，在节省成本方面也具有优势。试验将用过一次的磁性C18和PSA依次用丙酮10mL、甲醇10mL浸泡，并超声洗涤，该过程重复2次，回收后烘干。再次作为除杂吸附剂使用时，20mg磁性C18和20mg磁性PSA除杂效果接近首次使用，当重复利用4次后，需要另外增加10mg新的吸附剂即可达到首次使用的吸附效果。表明磁性C18和PSA重复使用率较高，降低了吸附剂使用成本。

2．4 工作曲线与检出限

在空白蜂蜜基质样品溶液中添加混合标准溶液，配制成质量分数分别为0．20，0．50，1．00，2．00，5．00，20．0，50．0，100．0μg·kg－1的混合标准溶液系列，按试验方法进行测定。以各化合物的质量分数为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制基质工作曲线。30种化合物的线性范围、线性回归方程及相关系数见表3。

分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算检出限（3S／N）和测定下限（10S／N），其结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab．3 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．5 精密度和回收试验

对空白基质分别添加10．0，20．0，50．0μg·kg－1的混合标准溶液进行加标回收试验，按照试验方法对每一个添加水平平行测定5次，计算其加标回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），其结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果（n＝5）Tab．4 Results of tests for precision and recovery（n＝5）

表4（续）

由表4可知：30种化合物的回收率在71．1%～116%之间，RSD小于22%。说明方法的精密度和准确度较高。

2．6样品分析

按试验方法对12个蜂蜜样品进行测定，其中7个蜂蜜样品有检出，其检出结果见表5。

表5 样品分析结果Tab．5 Analytical results of samples μg·kg－1

由表5可知：三唑类农药中苯醚甲环唑检出较多，质量分数在9．6～44．0μg·kg－1之间，喹诺酮类和四环素类药物也有检出，但质量分数均较低。

本工作建立了同时测定蜂蜜样品中15种三唑类农药和15种抗生素药物的QuEChERS－HPLCMS／MS分析方法，分别对提取剂、净化方法、吸附剂及其用量等样品前处理条件进行了优化，将磁性材料用于QuEChERS方法，缩短了测定时间。方法操作简便快速，净化效果好，适用蜂蜜中农药及抗生素的多残留检测。

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